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哺乳动物细胞蛋白表达案例

发表时间:2022-01-22 访问次数:548

一、实验设计

  根据客户的预期蛋白量、纯度以及蛋白用途等需求,通过哺乳系统来分泌表达纯化目的蛋白。设计思路为:密码子优化最适宜哺乳系统的基因序列,将目的蛋白序列构建到普健生物自主研发的高效表达载体pATX2,N端添加哺乳系统常用信号肽利于分泌表达,C端添加His标签,便于蛋白的检测和亲和纯化,瞬时转染哺乳细胞HEK293,通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况,收集培养基部分用镍柱亲和纯化获得目的蛋白。

二、蛋白性质分析

  2.1信号肽分析

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  2.2疏水性分析

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  2.3跨膜结构域分析

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  综上所述:

  1.目的蛋白理论分子量为 43KDa,适宜表达。

  2.对蛋白的信号肽,跨膜结构域和亲疏水性分析,蛋白整体疏水性略强。

  3.目的蛋白自身无信号肽,添加哺乳系统常用信号肽,利于蛋白分泌表达。

  4.在C端添加His标签,便于蛋白的检测和亲和纯化。

三、实验方法

  3.1 转染前一天,接种细胞到完全培养基中培养,使细胞在转染当天处于对数生长期。

  3.2 转染复合物的准备。

  3.3 转染:加入转染混合物到细胞悬液中,轻柔混匀后培养至细胞活率降到50%以下收样。

  3.4 收集表达后的细胞液,将培养基上清标记为culture medium;细胞加入1×PBS混匀,超声后离心,上清吸至新的EP管中,标记为NPE,沉淀加入1×PBS(含8M尿素),混匀,标记为DPE。

  3.5 镍柱亲和纯化:

  3.5.1 用PBS,pH 7.5缓冲液平衡镍柱,以0.5 ml/min流速上样;

  3.5.2 用Wash-Buffer以1 ml/min流速冲洗;

  3.5.3 用Elution-Buffer以1 ml/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液;

  3.5.4 将上述收集的蛋白溶液放入透析袋中,使用PBS(pH 7.5)进行透析过夜;

  3.5.5 进行SDS-PAGE分析。

四、实验结果

  4.1 蛋白镍柱亲和纯化样品SDS-PAGE分析:

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  4.2纯化后样品浓缩透析之后进行SDS-PAGE分析:

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  结论:目的蛋白已成功表达纯化,并且纯化得到的蛋白纯度较高,在90%以上。

五、样品信息

蛋白 浓度 规格 数量 总量
重组蛋白A 2.5 mg/ml 1.00 ml/vial 2 vials 5.00 mg

六、结论

  目的蛋白表达量为62.5 mg/L, 纯度大于90%。

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