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酵母表达系统

服务简介

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。它是甲醇营养型酵母菌,有两个乙醇氧化酶(Alcohol oxidase,AOX)编码基因AOX1和AOX2,两者序列相似,AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时,AOX1启动子可被甲醇诱导,启动乙醇氧化酶的表达,从而用甲醇进行代谢,含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

主要优势:

1.含有特有的强有力的AOX(醇氧化酶基因)启动子,用甲醇可严格地调控外源基因的表达

2.产物易分离,毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价,一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇,其余为无机盐,培养基中不含蛋白,有利于下游产品分离纯化

3.外源蛋白基因遗传稳定,外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中,不易丢失并能够得到高表达菌株

4.作为真核表达系统,毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构,具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能

表达菌株特点:

GS115:AOX1和AOX2基因都正常表达AOX蛋白(乙醇氧化酶),甲醇的利用效率高,接近于野生型,属于甲醇快速利用型(Mut+)

KM71:AOX1基因被大部分剔除,只能利用AOX2为AOX编码,甲醇利用速率变慢,表现为甲醇慢利用型(Muts)

外源基因的整合方式不同会导致表达菌株的表型不同:

Table 1. 酵母菌株表型

限制酶 插入位点 GS115 表型 KM71 表型
Sa1 I/StuI HIS4 HIS+Mut+ HIS+Muts
SacI 5’AOX1 HIS+Mut+ HIS+Muts
Bg1 II 取代AOX1 HIS+Muts HIS+Muts

 

Table 2. 表达载体信息

表达类型 载体名称 筛选标记 启动子
胞内表达 pAO815 HIS4 AOX1
pPIC3K HIS4 AOX1
pPIC3.5K HIS4 AOX1
分泌表达 pPICZα,A,B,C bler AOX1
pPIC9K HIS4 AOX1

 

 

对于胞外表达的蛋白除了可以用载体自带的信号肽,还有以下信号肽可供选择:

Table 3 . 信号肽序列

信号肽 蛋白序列
AlphaMF* MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEA
Dse4 MSFSSNVPQLFLLLVLLTNIVSG
Exg1 MNLYLITLLFASLCSA
Scw11 MLSTILNIFILLLFIQASLQ
SAlb MKWVTFISLLFLFSSAYS

 

服务优势

1.具有完备的毕赤酵母表达平台,可以根据蛋白特性或客户需求设计不同的实验方案

2.具有高通量筛选平台,可以快速有效地获得最佳表达条件

3.具有大规模发酵生产的能力

服务内容

服务内容 客户提供 服务步骤 服务周期 交付内容
毕赤酵母表达蛋白 基因序列
载体
菌株
基因合成,密码子优化 2-4周

蛋白样品

技术服务报告

亚克隆 1周
蛋白表达测试,高通量筛选 2-3周
发酵纯化 1-2周

案例展示

案例1:

  蛋白A全长基因合成后亚克隆至表达载体pPICZαA,转化毕赤酵母菌株X33,蛋白分泌表达成功(28kDa;C端6*His),产量7mg/L,纯度大于90%,质检图如下:

酵母表达系统

蛋白A 纯化质检图(Reduced SDS-PAGE)

 

案例2:

  蛋白B基因合成后亚克隆至表达载体pPIC3.5K分别转化毕赤酵母菌株GS115/KM71进行胞内表达,SDS-PAGE检测结果显示蛋白B(糖基化后40kDa)有明显表达,其中克隆GS115-5#(24h,0.5%甲醇),GS115-2#(48h,1%甲醇),GS115-3#(48h,1%甲醇)都能成功表达目的蛋白。

酵母表达系统

蛋白 B 表达测试图(Reduced SDS-PAGE)