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慢病毒安全稳定的基因操作工具

发表时间:2022-11-29 访问次数:290

RNAi 是由双链RNA分子介导,特异性降解同源性mRNA使其表达沉默的过程,是一种序列特异性的转录后基因沉默。RNAi技术日趋完善和成熟,目前已成为基因研究不可缺少的工具,并在功能基因组学、基因治疗学等多领域发挥强大作用。

RNAi的实现首先需要制备性质稳定、作用持久的小分子RNA,siRNA和shRNA都是RNAi技术中常用的小分子RNA。

实现RNAi效应,载体系统的选择同样重要。

目前载体系统主要分为非病毒载体和病毒载体系统两大类:非病毒载体具有低免疫原性、安全性较高的优点,但其转染效率往往较低;病毒载体因具有较高的转染效率而更多地被用于基因功能研究。常用的病毒载体主要包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等。

不同病毒载体对比:

载体种类 优势 不足
逆转录病毒 易包装获得,免疫原性低,高效感染,目的基因稳定地整合到靶细胞基因组而长期表达,且不产生辅助病毒。 滴度低,只能感染分裂期细胞。
腺病毒 转基因效率高,宿主范围较广,能感染几乎所有的细胞类型,能有效增殖,滴度高,遗传毒性较低,安全性高。 目的基因不能整合进宿主细胞基因组。
腺相关病毒 既可以感染分裂细胞,也可以感染静止细胞,免疫反应轻微。 携带外源基因的能力有限,整合时需要辅助病毒感染才能复制,滴度较低。

 

慢病毒载体

慢病毒载体是一种新型的基因转移载体,属于逆转录病毒科,为二倍体RNA病毒,几乎能够感染所有组织来源的细胞,可通过逆转录酶将病毒RNA逆转为DNA,通过病毒整合酶整合入宿主细胞基因组,使被感染的细胞及其子代细胞长期稳定表达病毒基因。常见的慢病毒有:HIV(人类免疫缺陷病毒)、FIV(猫免疫缺陷病毒)以及EIAV(马传染性贫血病毒)等。

慢病毒载体系统 是目前广泛使用的基因操作工具,已从第一代发展到至今的第三代,其稳定性及生物安全性不断改进和提高。

慢病毒载体系统由pGCSIL-GFP载体、pHelperl.0(gag/pol元件)载体、pHelper2.0(VSVG元件)载体三质粒组成,其中pGCSIL-GFP载体含有能持续表达小RNA的元件,同时能表达荧光蛋白GFP,pHelperl.0和pHelper2.0含有病毒包装所必需的元件。

 

pGCSIL-GFP 质粒图谱

 

pHelperl.0 质粒图谱

 

pHelper2.0 质粒图谱

普健生物具有完善慢病毒包装平台,可以完成慢病毒包装,稳定细胞系的构建。

普健生物慢病毒包装服务流程

1.构建慢病毒RNAi干扰载体,质粒提取。

2.慢病毒载体和包装系统共转染病毒包装细胞。

3.培养48~72小时,收集含有病毒的上清培养液。

4.病毒的纯化,浓缩,分装,-80℃保存。

5.目的基因滴度检测。

6.实验报告。