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SPR亲和力测定

发表时间:2022-01-22 访问次数:598

一、概述

  亲和力是判定分子间相互作用的重要参数,是了解分子以及药物的发现与筛选等的重要指标。对于药效的评价、生物大分子及其复合体的稳定性的评估需要从动力学、热力学和热稳定性等方面进行:包括分子间的结合、结合的快慢、结合的强弱、结合的机理等多方面的全面性研究。

  普健生物提供的表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)服务能够实现对蛋白,抗体、多肽、核酸及小分子化合物等相互作用的定性定量分析,也可以对细胞裂解液、文库样本等依托LSPR-Selex技术垂钓筛选未知靶标。

SPR亲和力测定SPR亲和力测定

 

SPR芯片工作原理示意图

 

二、服务内容

服务内容 交付内容

服务周期

样本准备(可选) 蛋白/抗体/多肽/核酸/小分子等      /
亲和力测定 亲和力检测报告;结合常数(Ka)、解离常数(Kd)、亲和常数(KD);响应曲线;亲和力强弱排序 2-3周

 

三、实验流程

  1、按照 OpenSPRTM 仪器标准操作程序安装 NTA 芯片。

  2、开始以最大流速(150 µL/min)运行,检测缓冲液PBS(pH7.4)。

  3、达到信号基线后,调整缓冲液的流速到20 µL/min。

  4、开始激活芯片,取出制备好的咪唑和NiCl2 溶液,通过进样口注入,与传感器相互作用5min完成芯片表面功能化,准备配体。

  5、用激活缓冲液稀释用于固定的配体, 体积为200µL浓度为10-50µg/mL ,通过进样口注入相互作用4 min。

  6、观察基线5 min,以确保稳定。

  7、通过比较注入配体前后的信号测量配体结合的量。如果需要更多的配体,可以再次注入配体。

  8、配体信号稳定之后,开始注入高浓度的分析物,以确认配体的活性,并确认表面大致的最大结合能力。

  9、将流速提高到150 µL/min,注入适当的再生缓冲液,以去除分析物。

  10、分析物用缓冲液稀释,浓度详见实验结果,并以20 µL/min 上样,蛋白与配体结合时间均为240 s;自然解离420 s。

  11、本次实验结果所使用分析软件为:TraceDrawer (Ridgeview Instruments ab, Sweden),分析方法是 One To One 分析模型。

四、结果分析

动力学及亲和力参数

参数

释义 结果
ka (1/(M*s)) 结合速率常数 2.82e5
kd (1/s) 解离速率常数 4.16e-4
KD (M) 解离平衡常数,也叫亲和力常数 1.48e-9
 

SPR亲和力测定

  结果说明:靶蛋白跟 Gidn 的亲和力为48 nM.

相关服务

  重组抗体表达   抗体人源化   双特异性抗体   杂交瘤测序