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昆虫系统蛋白表达服务案例

发表时间:2022-01-22 访问次数:346

一、 实验目的

  客户通过CO-IP实验证实A、B两个蛋白有相互作用,想进一步通过体外实验验证,其中A蛋白大小为45kDa,亲水性较好,选用大肠杆菌系统获得GST-A蛋白; B蛋白疏水性很强,且非常大(275kDa),普健根据多年蛋白制备经验,推荐客户选择用昆虫系统表达B蛋白(PS:昆虫杆状病毒能容纳大分子的插入片段,能包装大的基因片段)

二、 B蛋白制备流程

  1、 B蛋白分析:

  B蛋白一共2511AAs,无信号肽,无跨膜结构域,疏水性很强,选取1-2511AAs为表达目的片段,C端添加6*his标签;

  (1)信号肽分析结果:

  (2)疏水性分析结果:

  (3)跨膜区分析结果:

  1、 基因优化合成B蛋白,构建pFast-bac1-B表达质粒;

  2、 蓝白斑筛选方法获得重组的Bacmid,经PCR鉴定阳性后,转染sf9细胞,获得P1代病毒粒子,通过P1代表达测试,鉴定是否有目的蛋白表达;

  3、 生产P2代病毒粒子,进行MOI测试,选最优条件进行200ml放大及纯化,获得目的蛋白;

三、 实验结果

  图1:P1代表达测试结果

A. 考马斯亮蓝染色. B. His 标签抗体WB鉴定蛋白 (ECL曝光).

  图2:P2代MOI测试结果

考马斯亮蓝染色

  图3:样品纯化后QC结果

杆状病毒-昆虫细胞蛋白表达服务

A.考马斯亮蓝染色. B. His 标签抗体WB鉴定蛋白 (ECL曝光).

  实验结果分析:

  SDS-PAGE结果显示260kDa左右有条带,通过His 标签,WB检测曝出与目的蛋白大小一致的条带,说明SDS-PAGE胶上的条带为目的蛋白条带,蛋白纯度为90%。

  蛋白表达量为:200ml可纯化到1.8mg His-B蛋白

  图4:GST-A蛋白与HIS-B蛋白GST pull down实验结果

  结论:GST-A蛋白与His-B蛋白是有相互作用的。

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