一文搞定CHO稳转细胞株构建

随着生物技术的迅猛发展,全球化资源整合为生物制药行业提供了越来越全面的技术支撑,抗体药物的发展也获得越来越多的重视。抗体药物开发是一个非常繁杂的过程,而稳定细胞株适用于抗体药开发的各个阶段,如重组蛋白和抗体生产、检测分析、功能性研究等等。构建适用于工业生产的高表达细胞株是第一步也是关键步骤之一。

普健生物在重组蛋白表达、抗体生产及稳转细胞株构建等方面有着10余年经验。今天小普与大家分享一种基于CHO细胞株构建的高效抗体药开发策略,能显著提高细胞株开发效率,实现高效、稳定的细胞株开发。

哺乳动物细胞是用于生产单抗在内的商业化治疗性蛋白产品的主要宿主细胞。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是生产蛋白类药物的首选宿主细胞,因为与其他系统相比,CHO细胞具有以下优点：

①CHO 细胞对蛋白有准确的加工、修饰功能,因此其表达的蛋白质的生物学活性更接近于天然蛋白；

②CHO 细胞耐受剪切力和渗透压的能力相对较强,可根据培养要求选择贴壁培养或悬浮培养的方式；

③整合外源基因后的细胞稳定,重组基因能高效扩增和表达；

④表达目的蛋白可由细胞内运输到细胞外,并且CHO 细胞只表达少量的内源蛋白,有利于目的蛋白的提取。

哺乳动物细胞的培养生长过程需要谷氨酰胺（L-glutamine），谷氨酰胺合成酶（GS)将谷氨酸和氨转化为谷氨酰胺，哺乳动物细胞通过这一酶促反应获得谷氨酰胺。

CHO细胞内源的谷氨酰胺合成酶活性比较低,需要在培养基中额外添加外源谷氨酰胺才能促进细胞生长。利用GS抑制剂,L-氨基亚砜蛋氨酸(Methionine Sulphoximine，MSX)抑制内源性GS活性，用含目的基因和GS基因标记的表达载体,转染宿主CHO细胞,通过MSX加压筛选，促使GS基因和目的蛋白基因扩增,只有转染了额外GS基因的细胞才可以在不含有谷氨酰胺（L-glutamine）的培养基中生长,从而筛选获得重组表达细胞株。

工业上主要使用两大类CHO细胞：

①GS野生型,含弱的GS活性(GS WT):CHO-K1(ATCC CCL-61,ECACC 85051005)，CHOK1SV(lonza);

②GS缺陷型,敲除GS活性(GS KO):CHOK1SV-KO(Lonza),CHOZN(Merk),HD-BIOP3(Horizon)。

细胞转染是将外源分子(如DNA,RNA)导入真核细胞，细胞株筛选方案包括一系列步骤：

构建生产重组抗体的CHO稳定细胞株。

Fig.1 单克隆产量分析

Fig.2 流加表达测试产量优化

Fig.3 抗体聚体分析（SEC-HPLC）

Fig.4 抗体亲和力分析（Biacore）

Fig.5 细胞株稳定性分析图

XtenCHO^TM高密度表达系统的转染试剂、表达培养基和补料培养基相较于常用的阳离子脂质体转染试剂、商业化CHO培养基以及补料培养基,成本大大降低,更适用于工业生产,在规模较大的重组蛋白瞬时表达生产中更能体现其性价比高的特点。

普健生物拥有高效的CHO稳定细胞株构建体系，从上游的杂交瘤抗体测序，到序列优化，人源化，再到细胞株构建，个性化细胞株优化及质控检测，整个技术体系成熟，仪器配备齐全，能够快速助力抗体药的临床前研究。普健生物凭借十余年的抗体药物研发项目经验，自主开发了CHO-GS KO细胞系及GS载体系统，抗体表达产量>3g/L以上。自主研发了CHO细胞专利转染技术，及提高抗体产量的稳定细胞株筛选技术。拥有完善的抗体质量分析平台，可以提供ELISA、FACS、还原/非还原SDS-PAGE、SDS-CE、SEC-HPLC、LC-MS、ADCC和Biacore等分析。