酵母表达系统

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOX)编码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

主要优势：

1.含有特有的强有力的AOX(醇氧化酶基因)启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达

2.产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化

3.外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能够得到高表达菌株

4.作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能

表达菌株特点：

GS115：AOX1和AOX2基因都正常表达AOX蛋白(乙醇氧化酶)，甲醇的利用效率高，接近于野生型，属于甲醇快速利用型(Mut+)

KM71：AOX1基因被大部分剔除，只能利用AOX2为AOX编码，甲醇利用速率变慢，表现为甲醇慢利用型(Muts)

外源基因的整合方式不同会导致表达菌株的表型不同：

Table 1. 酵母菌株表型

Table 2. 表达载体信息

对于胞外表达的蛋白除了可以用载体自带的信号肽，还有以下信号肽可供选择：

Table 3 . 信号肽序列

1.具有完备的毕赤酵母表达平台，可以根据蛋白特性或客户需求设计不同的实验方案

2.具有高通量筛选平台，可以快速有效地获得最佳表达条件

3.具有大规模发酵生产的能力

案例1：

　　蛋白A全长基因合成后亚克隆至表达载体pPICZαA，转化毕赤酵母菌株X33，蛋白分泌表达成功(28kDa;C端6*His)，产量7mg/L，纯度大于90%，质检图如下：

蛋白A 纯化质检图（Reduced SDS-PAGE）

案例2：

　　蛋白B基因合成后亚克隆至表达载体pPIC3.5K分别转化毕赤酵母菌株GS115/KM71进行胞内表达，SDS-PAGE检测结果显示蛋白B(糖基化后40kDa)有明显表达，其中克隆GS115-5#(24h，0.5%甲醇)，GS115-2#(48h，1%甲醇)，GS115-3#(48h，1%甲醇)都能成功表达目的蛋白。

蛋白 B 表达测试图（Reduced SDS-PAGE）