昆虫杆状病毒表达系统,真核表达系统,外源蛋白表达-普健生物

服务简介

昆虫杆状病毒表达系统 (BEVS) 是一种利用杆状病毒作为外源基因的载体，通过感染昆虫细胞或者昆虫幼虫来表达外源蛋白的系统，是重要的真核表达系统之一。

1.昆虫杆状病毒表达系统的优势：

a.杆状病毒安全性好

b.携带外源基因的容量大

c.外源目的蛋白质表达水平高

d.表达的真核基因产品可以进行正确的折叠与修饰，因而具有良好的生物活性。

2.与哺乳细胞相比昆虫表达系统的优势：

a.培养条件相对简单，不需要CO₂

b.不容易被细菌污染

c.能进行蛋白翻译后糖基化修饰

d.大规模生产条件简单，更易获得大量蛋白

常见的表达载体及特征

载体	特征
pFastBac1	用于高水平蛋白表达的强AcMNPV多角体基因 (PH)启动子用于简化克隆的大型多克隆站点
pFastBacHT	用于高水平蛋白表达的强多角体（PH）启动子用于使用金属螯合树脂纯化重组融合蛋白的N端6His标签，以及用于在蛋白纯化后去除6His标签的TEV蛋白酶裂解位点用于简化克隆的三个读码框的载体
pFastBacDual	用于同时表达两种蛋白的两个强杆状病毒启动子（PH 和 p10）用于简化克隆的两个大型多克隆位点

常见的表达细胞及特征

细胞	来源	用途
Sf9	Sf9细胞系克隆分IPLBSF21-AE(Sf21)，来源于秋蝇蠕虫(草地夜蛾)蛹的卵巢组织	适于转染、纯化、生产高滴度病毒、铺板以及表达重组蛋白
Sf21	Sf21细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，也来源于秋蝇蠕虫(草地夜蛾)蛹的卵巢组织	也适于转染、纯化、生产高滴度病毒、铺板以及表达重组蛋白。在一些结构上Sf21细胞可能比Sf9细胞表达蛋白量高
Hi5	Hi5细胞系源于博伊斯汤普森研究所对植物的研究和源于白菜尺蠖卵巢细胞，粉纹夜蛾细胞	Hi5细胞表达重组病毒性能优越, 经常用于转染和空斑纯化，也适用于表达分泌型重组蛋白
S2	S2是一种果蝇晚期胚胎细胞。其中多为雌性四倍体细胞，也有双倍体细胞	比较适合重组蛋白的表达

服务优势

1.普健生物利用经典Bac-to-Bac技术，打造了一个快速简便高效的杆状病毒表达平台; 该技术能够快速地产生重组病毒，而且不需要繁琐的空斑分析，大大提高了效率。

2.蛋白生产的周期短，通量大。可以实现细胞从小规模培养到大规模发酵的过程，使得蛋白产物甚至可以达到100mg/L的级别。

3.提供免费的病毒粒子扩增和储存服务，储存期长达2年。

服务内容

服务项目

客户提供

服务内容

服务周期

交付内容

昆虫杆状病毒表达蛋白

基因序列

载体

基因合成及密码子优化

载体构建

病毒包装及扩增

表达纯化测试

放大生产及纯化

服务报告

6-8 周

蛋白样品

技术服务报告

案例展示

案例1 昆虫-杆状病毒系统表达大蛋白A(272 KD)

　　普健采用昆虫-杆状病毒表达系统，C端融合6*His标签表达了大小为272 KD的蛋白A，经过P1代表达测试，病毒扩增后分别转染Sf细胞和Tn细胞测定MOI，选取最佳表达条件进行P2代表达测试和200ml表达纯化，最终得到的蛋白A纯度90%，产量5mg/L。

图1 蛋白A P1代表达纯化测试结果( 还原SDS-PAGE )
A.考马斯亮蓝染色. B. WB (ECL发光，抗His标签抗体).
ø.阴性对照培养基. 1 和 2.转染的 1和2号克隆. Medium:培养基. NPE. 可溶上清. DPE. 沉淀. +. 阳性对照.

图2.蛋白A 在Sf 和 Tn 细胞中的P2 代表达测试(还原 SDS-PAGE).
考马斯亮蓝染色 Ø.阴性对照. D2-D3. 转染后天数. +. 阳性对照.

图3.蛋白A 在Sf 和 Tn 细胞中的P2 代表达测试情况-WB验证(还原 SDS-PAGE ).
Ø.阴性对照. D2-D3. 转染后天数. +. 阳性对照.

图4.蛋白A纯化质检图(还原 SDS-PAGE )
A.考马斯亮蓝染色. B. WB (ECL发光;抗His标签抗体). MW. 分子量标记.

案例2 昆虫-杆状病毒系统表达G蛋白偶联受体(蛋白B)

　　普健生物采用昆虫-杆状病毒表达系统，N端融合10*His和Flag标签表达了大小为42 KD的G蛋白偶联受体-蛋白B(7次跨膜区，2个糖基化位点)，经过P1代表达测试，病毒扩增后分别转染Sf细胞和Tn细胞测定MOI，选取最佳表达条件进行P2代表达测试和200 ml表达纯化，最终得到的蛋白B用biacore测定了跟配体的亲和力，亲和力在uM级。

图1.蛋白B P2代表达纯化测试（Sf和Tn细胞）.
还原SDS-PAGE及考马斯蓝染色.
Ø.阴性对照.D2-D3.感染后天数.
Medium:培养基.NPE.可溶性上清.DPE.沉淀.

图2 P2代表达测试WB验证(Sf和Tn细胞；ECL发光法；抗His标签抗体).
Ø.阴性对照. D2-D3.感染后天数.+.阳性对照.Medium:培养基.NPE.可溶性上清.DPE.沉淀.

图3 蛋白B纯化质检图（还原SDS-PAGE；考马斯蓝染色）
MW.分子量标记.

图4. 蛋白B跟配体亲和力测定结果