鉴定猪流行性腹泻病毒重组蛋白免疫原性的实验操作流程

猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV）是尼多病毒目（Nidovirales,又叫巢穴病毒目或套式病毒目）、冠状病毒科（Coronaviridae）的α冠状病毒属成员，能够引起新生仔猪急性腹泻、呕吐、脱水甚至死亡。

PEDV表面具有1个18~23nm纤突的囊膜结构，纤突呈花瓣状，由核心向四周呈放射状分布，纤突末端呈球状；病毒直径为95~190nm，是一种单股正链、不分节段RNA病毒。PEDV基因组大小约为28kb，含有７个开放阅读框，分别编码大小为150~220kDa的病毒纤突糖蛋白（S）、20~30kDa的基质蛋白（M）、7kDa的主要嵌膜蛋白（E）、58kDa的核衣壳蛋白（N）与其他蛋白。病毒表面的纤突蛋白（spike，S）具有介导细胞附着和膜融合的作用。

目前预防猪流行性腹泻（PED）的疫苗常用甲醛氢氧化铝灭活苗，但疫苗株与近期流行株同源性较低，能保护仔猪免受PEDV流行株感染的高效廉价的疫苗需求更加迫切。为此，来自中国农业科学院的研究团队针对高发的GⅡ-a型流行株猪PEDV的纤突蛋白中的受体结合区（re-ceptor-bindingdomain,RDB），应用昆虫杆状病毒表达系统构建并表达了PEDV-RDB基因，通过仔猪试验，分析其免疫原性，为PED亚单位疫苗研制提供新思路。
PEDV-RDB基因在昆虫杆状病毒中的表达与鉴定
根据PEDV S蛋白基因序列(AKN45969.1)将目的基因设计合成之后，将合成的基因PEDV-RBD亚克隆至杆状病毒双表达载体的PH启动子下游，进行重组和鉴定。对重组杆粒Bacmid-PER进行鉴定，利用引物进行PCR扩增，鉴定成功后随后对其进行转染，获得重组杆状病毒rBV-PER。

PEDV-RBD基因结构示意图

左：重组质粒鉴定 右：PCR鉴定

最后利用Anti-strep tag抗体和抗PEDV S蛋白抗体对重组杆状病毒进行IFA鉴定，表明外源PEDV-RBD基因在杆状病毒中成功表达。

IFA鉴定PEDV-RBD蛋白的表达

重组蛋白pFBD-PER的Western blot鉴定

普健生物昆虫杆状病毒表达系统物利用经典Bac-to-Bac 技术，打造了一个快速简便高效的杆状病毒表达平台；能够快速地产生重组病毒，而且不需要繁琐的空斑分析，大大提高了效率，蛋白生产的周期短，通量大。可以实现细胞从小规模培养到大规模发酵的过程，使得蛋白产物甚至可以达到100mg/L 的级别。如果您有相关重组蛋白表达和制备需求，欢迎联系027-87001869与我们的专员进行沟通！
利用杆状病毒表达系统制备猪流行性腹泻病毒（PEDV）纤突蛋白受体结合区（RDB）重组蛋 白（PEDV-RDB），将其免疫３周龄断乳仔猪，分析其免疫原性。将PEDV-RBDP3代重组杆状病毒接种到悬浮SF9细胞中，收获后离心取上清液，将上清液超速离心浓缩重组蛋白。将仔 猪分为免疫组、空载体对照组和佐剂对照组，分别用制备的重组蛋白、空载体表达产物和单纯佐剂免疫仔猪。

特异性抗体检测结果

左：仔猪血清中和抗体检测结果 右：流式细胞术分析

结果显示，免疫后８周，PEDV-RDB重组蛋白组产生的特异性抗体效价达1:12800，中和抗体平均效价1:284，最高达1:512。流式细胞术分析CD3+CD4+双阳性Ｔ淋巴细胞显著高于对照组，表明重组蛋白具有良好的免疫原性，能够激发仔猪的体液免疫和细胞免疫应答。

这项研究这为进一步利用杆状病毒载体制备亚单位疫苗奠定了基础，也为利用昆虫杆状病毒表达系统进行其他冠状病毒蛋白的免疫研究提供了借鉴和参考。

参考文献

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