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结核病( tuberculosis，TB) 是由结核分枝杆菌( Mycobacterium tuberculosis，MTB )引起的传染 病。结核分枝杆菌（MTB）俗称结核杆菌（tubercle bacillus），菌细长略弯曲，有时可见分枝，呈单、成堆或成束排列，无鞭毛、无芽胞，有荚膜。可出现多形性，在陈旧的病灶和培养物中，形态常不典型，可呈颗粒状，串球状，短棒状，长丝形等。MTB革兰染色阳性，不产生内外毒素。
Genome of M. tuberculosis
结核分枝杆菌基因组大小为4.4 Mb，基因组G/C含量高达65.6%，预测含4411个开放阅读框(ORF)，其中3924个ORF被认为编码蛋白质，50个基因编码稳定的RNA。如由MTB Rv3875基因编码的早期分泌抗原靶6 kDa蛋白(early secretory antigenic target of 6 kDa, ESAT-6)能诱导强烈的T细胞免疫应答，并提供一定的抗结核免疫保护；Rv3804c基因编码的Ag85A蛋白是MTB的主要分泌蛋白Ag85复合物成分之一，可使细胞毒性T细胞的细胞毒活力升高；Rv2660c基因编码的蛋白在MTB处于休眠状态时仍能持续表达，提示Rv2660c基因可作为清除潜伏性感染阶段MTB的作用靶点；Rv3428c位于MTB的RD11 区，编码插入序列IS1532 的转座酶，可引起体内的细胞与体液免疫，Rv3428c编码的重组蛋白具有增加γ－干扰素在小鼠中的表达潜力，可作开发结核疫苗的融合抗原。有研究表明Rv3428c重组蛋白有较高的临床应用价值，Rv3428c的重组蛋白辅助诊断阴性菌的肺结核有81. 5%灵敏度和82. 0%特异度。
为进一步探讨Rv3428c在MTB特异性诊断中的研究价值，来自四川大学华西公共卫生学院的研究人员通过同源重组得到pET28a-Rv3428c表达载体，转入E. coli BL21( DE3)后进行IPTG诱导表达，用Ni-NTA亲和层析纯化目的蛋白。重组蛋白免疫小鼠后进行细胞融合，间接ELISA、Western Blot筛选阳性杂交瘤细胞系，以筛选获得的阳性杂交瘤细胞诱导小鼠产生腹水，蛋白A亲和层析法纯化抗体，BCA法测定浓度，ELISA和SDS-PAGE进行单克隆抗体的鉴定及亚型和效价的测定。
Construction and identification of pET28a－Rv3428c vector
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最终测序结果表明，插入序列与MTB H37Rv基因组Rv3428c公布的序列一致，表明原核表达载体构建成功。对重组蛋白进行大量表达与纯化，纯化的重组蛋白使用超滤管进行超滤浓缩，SDS－PAGE分析目的蛋白的表达。
Abundantly expression and purification of pET28a－Rv3428c recombinant protein
随后，通过Western blot筛选出一株效果好的阳性杂交瘤细胞株，通过体内诱生法制备获得Rv3428c单克隆抗体。该单抗属于IgG2a亚类，κ型轻链，效价约为1∶128000，浓度为4 mg /ml。
Purification and identification of Anti－Rv3428c Monoclonal Antibody
Determination of purified anti－Rv3428c－mAb titer by ELISA
Identification of monoclonal antibody subtypes by ELISA
Identification of Anti-Rv3428c Monoclonal Antibody Subtypes
关于MTB诊断抗原的研究有很多，但应用于检测抗原的研究相对比较空白。Rv3428c特异性地在结核分枝杆菌中表达，其他分枝杆菌中不存在该基因，因此特异性好。这项研究成功构建了MTB的RD11区Rv3428c 表达载体，大量表达并纯化蛋白，成功制备Rv3428c单克隆抗体。为后续探索其在临床样本中的应用价值，为临床MTB快速抗原检测试剂盒提供参考，为寻找早期、方便快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法奠定基础。
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