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纳米抗体衍生于骆驼科动物的重链抗体，是目前多种生物医学应用中的重要工具。当前获得纳米抗体的主要方法是构建羊驼纳米抗体噬菌体展示文库，通过抗原淘选，从噬菌体展示文库中淘选出高亲和力的纳米抗体。
在本综述中，我们探讨了推动纳米抗体设计与优化的结构特征、功能属性及计算方法。我们分析了其独特的抗原结合域，强调了互补决定区（CDR）在目标识别及其特异性中的关键作用。此外，本综述还从生物学角度阐述了纳米抗体相对于传统抗体的优势，包括其小尺寸、高稳定性和良好溶解性，这些特性使其成为诊断、治疗和生物传感中高效低成本的抗原捕获抗体。
图1. 常规抗体，单链抗体和纳米抗体
传统全长抗体存在于人类及其他哺乳动物体内，是由多个结构域组成的Y形分子（如图1所示）。每个抗体由两条相同的重链（包含VH、CH1、CH2和CH3结构域）和两条相同的轻链（包含VL和CL结构域）组成。重链的恒定区CH2和CH3构成Fc区域。Y形结构的两个“臂”被称为抗原结合片段（Fab区），由两个重链可变区（VH）和两个轻链可变区（VL）以及两个恒定区（CH1和CL）组成。
抗原结合位点，也称为抗原决定簇，位于抗体“臂”的末端，处于由重链（VH）和轻链（VL）的可变区形成的口袋或槽中。这些结合位点由六个超变去组成，通常称为互补决定区（CDR）。重组的抗体片段，如Fab片段、scFv、纳米抗体（如图1所示）及多价工程化变体，是有效的抗原结合分子。这些片段保留了完整单克隆抗体的靶向特异性，同时提供了适合各种诊断和治疗应用的独特优势。它们被广泛用于体外成像和诊断的示踪剂、生物传感器的开发，以及靶向癌症和SARS-CoV-2等多种疾病的治疗手段。
纳米抗体（Nanobodies），也称为VHH或单域抗体，由于缺少轻链，是从仅有重链的抗体中衍生出来的小型抗体片段。1993年首次在骆驼血清中被报道发现，但在其他骆驼科动物如羊驼、美洲驼以及鲨鱼体内也存在。普健生物可提供骆驼，羊驼，美洲驼三种驼科动物的天然噬菌体展示文库淘选和免疫噬菌体展示文库淘选服务。天然噬菌体展示文库淘选得到的序列重组表达后亲和力可以达到10-9 M级，免疫噬菌体展示文库淘选得到的序列重组表达后亲和力可以达到10-10 M级。
纳米抗体仅有三个互补决定区（CDR），其可单独作为抗原结合区域，并且其结合亲和力与单克隆抗体相当。纳米抗体甚至能够与隐蔽表位相互作用，这些表位是传统抗体无法接触到的，例如酶活性位点以及SARS-CoV-2刺突蛋白中的表位。与抗体类似，纳米抗体也含有免疫球蛋白样的β-夹层结构，该结构由反平行的β-链组成，并排列成两个片层，由内部的二硫键保持其稳定性（如图1）。这种结构框架为构成结合表面的三个CDR区提供了稳定性。这些CDR区的长度、组成和结构具有可变性，其中CDR3的序列变异性最大，长度范围为12至18个残基，因此被认为是抗原结合特异性的重要贡献者之一。值得注意的是，纳米抗体通常具有比抗体更长的CDR3区，并且可以采用连接或扩展的构象，使纳米抗体能够通过手指状的抗原结合位点进入常规抗体无法接触的结合口袋。因此，纳米抗体中的CDR3区占据的构象空间比抗体中的更大，因为其不受与配对轻链域的限制。纳米抗体的CDR3区通常贡献了整个结合位面超过50%的结合相互作用。纳米抗体的其余部分由四个区域组成，其序列和结构比常规抗体更为保守，称为框架区（framework regions）。纳米抗体中对应常规抗体VH-VL界面的区域表现出比其他抗体片段（如Fab和scFv）更高的亲水性，这一特性减少了自我结合或二聚化的可能性，从而确保纳米抗体保持单体状态。总体而言，纳米抗体的结合位面在结构片段、用于抗原相互作用的残基以及与抗原建立的接触种类方面表现出比常规抗体更大的多样性。
与传统抗体（分子量约150 kDa）相比，纳米抗体具有多种优势，包括较小的分子量（约110个氨基酸，分子量约12–15 kDa）、出色的稳定性和良好的溶解性，同时仍能保持与传统抗体相似的高亲和力结合能力。此外，纳米抗体因其优异的生化特性——如高热稳定性、强组织渗透性和低免疫原性——而备受关注。纳米抗体还可以通过细菌表达系统以经济高效的方式大量生产，纳米抗体可以通过大肠杆菌系统分泌到周质空间表达成功。但是，相比之下，较昂贵的真核表达系统(如普健生物的XtenCHO哺乳细胞表达系统)表达得到的纳米抗体通常具有更高的生物学活性。由于这些有利特性，纳米抗体及其衍生物在许多生化应用中正逐步替代传统抗体。此外，纳米抗体还作为新型工具，解决了传统抗体无法应对的研究挑战。例如，纳米抗体被用于稳定蛋白质构象状态及其动态性，甚至能够调控G蛋白偶联受体的变构调节。它们还被用作载体蛋白，用于便捷地检测与免疫检查点蛋白程序性死亡受体1（PD-1）结合的肽。诸如Legobodies（由纳米抗体、Fab片段和融合蛋白组成的复合体）和Megabodies（将纳米抗体嫁接到球形刚性细菌蛋白上）等新型复合体被用来通过单颗粒冷冻电子显微镜解析小蛋白的结构，从而增加粒子分子量。
纳米抗体通常通过免疫动物（如羊驼或骆驼）来获得，即将目标抗原注射到动物体内，通过构建和淘选噬菌体展示文库的方法获得抗体序列。然而，随着定向进化技术的进步，纳米抗体库现在可以完全通过合成方法构建噬菌体展示突变文库，在几周内生成。这些噬菌体展示文库的主要差异通常体现在CDR-H3长度上，形成了三种独特的相互作用表面：凹面、突出环和凸形结合面。这些库可用于选择与目标蛋白结合的分子，包括膜蛋白以及稀有构象状态下的蛋白质。
除了在基础生化研究中的广泛应用外，纳米抗体也越来越多地被用作诊断工具、分子成像探针和治疗剂。目前，纳米抗体正用于多种人类疾病的临床研究，涵盖乳腺癌、脑肿瘤、肺部疾病和传染病等病症。纳米抗体还能够靶向各种肿瘤，并已应用于前列腺癌的诊断和治疗。自2019年以来，特别是在新冠疫情期间，许多研究（包括计算蛋白质设计）开始探索纳米抗体作为抗病毒剂的潜力。纳米抗体被工程化设计以特异性靶向SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域（RBD），包括针对奥密克戎变种的设计，从而阻止病毒与人体血管紧张素转化酶2（ACE2）的相互作用。通过与刺突蛋白结合，纳米抗体干扰了病毒感染人体细胞的能力，并有可能中和其传染性。
普健生物可利用噬菌体展示技术制备高生物活性和高亲和力的纳米抗体，欢迎咨询！
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参考文献：Nanobody engineering: computational modelling and design for biomedical and therapeutic applications
