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上篇流式小课堂的第一期，我们带大家简单了解流式检测平台【第一期】流式小课堂。从本篇开始我们将以 step by step 的方式各个击破关于流式实验的相关难点。
我们知道流式细胞术是基于特定激光激发下，细胞产生的荧光被流式仪接收器接收。那么流式仪所接收的光信号一定就是应该素被激发之后所产生的吗？答案是否。这里我们要引入一个概念---非特异性荧光。所谓非特异性荧光是指：细胞表面的某些分子或者结构能够产生荧光，这种荧光相对于荧光素产生的荧光较弱，并且与细胞表面的特异抗原分子没有相关性。由于非特异性荧光的存在，在特定激光激发下，细胞产生的荧光并不是绝对的有或者无，细胞表面不结合流式荧光素也会产生荧光信号。这就给我们分析流式结果时带来了一定的难度，相当于我们通过流式检测时得到的荧光信号是细胞本身的非特异性荧光和来自于细胞表面结合的荧光素的特异性荧光叠加得到的结果。
阴性对照
由于存在光信号叠加，因此在分析流式结果时我们需要比较荧光信号与细胞的非特异性荧光。如果得到的荧光信号大于非特异性荧光，说明得到的荧光信号部分来源于荧光素的特异性荧光，就可以得出细胞表达相应的抗原分子的结论。所以，确定与荧光素无关的细胞自身的非特异性荧光的强弱非常重要，设立阴性对照就是为了确定细胞的非特异性荧光。
上图为3类阴性对照和标记荧光素偶联抗体(抗CD69-PE)得到的荧光信号的示意图。相比于前面3类阴性对照，可以得出这群样品细胞中有30％的细胞表达有CD69抗原分子。如果没有阴性对照作为参照，直接根据最后标记荧光素偶联抗体组的荧光信号无法判断样品细胞中有多少比例的细胞表面结合有PE荧光素，从而也就无法判断有多少比例的细胞表达CD69抗原分子。
第1类
negative
“negative”表示的是不加任何荧光素偶联抗体时得到的荧光信号，因为没有标记任何荧光素，所以这组得到的荧光信号与荧光素无关，与细胞抗原分子是否表达无关，得到的荧光信号代表的是非特异性荧光信号；
第2类
抗CD69
“抗CD69”表示的是用抗CD69抗体标记样品细胞后得到的荧光信号，虽然抗CD69抗体能够与细胞表面的CD69抗原分子结合，但是抗CD69抗体没有偶联荧光素，所以得到的荧光信号也与细胞表面是否表达有CD69分子无关，得到的荧光信号代表的也只是细胞本身的非特异性荧光，所以这种对照用于排除抗体的影响；
第3类
IgG1-PE
“IgG1-PE”表示的是标记与抗CD69抗体同种属（来源于同一物种）且同类（抗CD69-PE中的抗体是IgG1类的）的非特异性抗体（IgG1）与PE荧光素偶联的同型（isotype）对照抗体（IgG1-PE）后，得到的荧光信号，这种同型对照抗体不能与细胞表面的CD69发生特异性结合，所以细胞表面不会结合有IgG1-PE，最后得到的荧光信号不是PE荧光素产生的特异性荧光信号，而是代表细胞本身的非特异性荧光，所以这种对照用于排除荧光素的影响。第3类同型对照抗体就是我们在流式实验中最常设置的同型对照。
FMO对照
减一阴性对照（Fluorescence-minus-onecontrol，FMO对照）是一种特殊的阴性对照，是指在多色（通道）分析时对其中某一个通道特别设置的阴性对照，多在研究不同细胞亚群表达某些重要的表型分子、细胞因子等时应用。
如需要研究人外周血单个核细（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中CD62L+CD4+和CD62L-CD4+两个细胞亚群表达CD45RA这个重要表型分子的表达情况时，需要同时标记不同荧光素偶联的抗人CD4、CD62L和CD45RA抗体，除了常规的阴性对照设置，最好再设置一组FMO对照，就是只标记荧光素偶联抗人CD4和CD62L抗体，而不标记荧光素偶联的抗人CD45RA抗体，然后将CD62L+CD4+和CD62L-CD4+细胞亚群分别设门，将两群细胞分别显示于新的散点图中，散点图上其中一个轴代表CD45RA的荧光信号，这时就可以分别设置这两个细胞亚群CD45RA通道的阴阳性界线，然后再上样分析实验组，根据不同细胞亚群各自的阴阳性界线分别判定细胞亚群各自表达CD45RA的情况。这种特殊的阴性对照就是FMO对照。因为不同细胞亚群的非特异性荧光可能存在差异，而且不同细胞亚群结合有不同的荧光素偶联抗体从而使它们的最佳补偿值存在差异，当在统一的补偿条件下同时分析时，不同细胞亚群在某一通道的阴阳性界线就可能存在差异，普通阴性对照无法进一步区分这种差异，而FMO对照就可以通过只缺少标记这一通道代表的荧光素偶联抗体，精确界定不同细胞亚群各自的这一通道的阴阳性界线，从而使流式分析结果更加精确。
阳性对照
说完了阴性对照，我们来讲讲阳性对照的设置。流式实验的阳性对照，是指在使用某种荧光素偶联抗体前先检测该荧光素偶联抗体是否有效。
阳性对照并不是每次流式分析时都必须设置，以下是需要设置阳性对照的情况，给大家参考判断：
1.使用新的荧光素偶联抗体时，该荧光素偶联抗体以前没有使用过。
2.换用不同公司的或者同一公司但不同批号的荧光素偶联抗体时。
3.使用储存时间较长的荧光素偶联抗体时。
当出现以上三种情况时，荧光素偶联抗体会因为失效而导致无法与抗原分子结合产生特异性的荧光信号，从而得到一个假阴性的结果。
设置阳性对照通常我们使用以下两种方法：
01
肯定表达有相应抗原分子的样品细胞来检测，如检测荧光素（不管哪种荧光素）偶联的抗小鼠CD4抗体，可以用该抗体标记正常小鼠的脾脏细胞，因为该细胞内肯定有CD4阳性细胞，而且已知CD4阳性细胞占脾脏细胞的大致比例范围，所以如果用该抗体标记脾脏细胞得到意料中的结果时，就可以认为该抗体有效；
02
如果实验室有已证明有效地与待测荧光素偶联抗体的单克隆抗体相同但偶联的荧光素不同的荧光素偶联抗体，如需检测FITC偶联的抗小鼠CD4抗体（FITC-CD4抗体）是否有效，实验室已有证明有效的PE偶联的抗小鼠CD4抗体（PE-CD4抗体），这时可以用这两种荧光素偶联抗体同时标记同一份肯定表达有相抗原分子（CD4分子）的样品细胞，流式检测后如果PE阳性的细胞FITC也是阳性的，PE阴性的细胞FITC也是阴性的，就可以证明该待测的荧光素偶联抗体有效。
以上就是关于流式实验中对照设置的相关知识，下一篇我们将继续介绍流式实验如何选择流式细胞术常用的荧光素。敬请期待~
关于普健
普健生物（AtaGenix）于2012年在武汉成立，作为武汉国家生物产业基地公共服务平台—光谷抗体发现与筛选公共服务平台。普健生物（AtaGenix）专注于重组蛋白、抗体、诊断原料、抗体药物发现等自主技术平台的建设和下游生物医药产品的战略合作。经过10年的发展，普健生物已成为一家立足武汉，业务覆盖全国、辐射全球的高新技术服务企业。目前公司拥有4200平米自建实验室（包含800平高标准BSL-2级细胞房），拥有齐全蛋白抗体开发设备500余套，包括高通量蛋白纯化仪、Agilent 流式细胞分析仪，全自动HPLC分析仪，openSPR蛋白、抗体亲和力测定仪，Olympus荧光显微镜， BTX电融合仪，微生物发酵罐，中试型高压均质机，全自动管式化学发光仪，以及配套的高速离心机，细胞计数仪及大容量细胞培养摇床。公司先后获得荣誉：3551人才计划、高新技术企业、技术先进型服务企业、光谷瞪羚企业
