2017年以来两个产品的临床获批极大的引起了国内业界的广泛关注，给国内双特异性抗体玩家少、市场大、未来空间广的市场行情注入了强有力的催化剂。其一是： 2017年武汉友芝友生物制药有限公司自主开发的“注射用重组抗HER2和CD3人源化双特异性抗体” (项目编号“M802”)获得国家食品药品监督管理总局（cFDA）颁发的首个双特异性抗体药物临床试验批件。其二是 ：2018年，“注射用重组抗EpCAM和CD3人鼠嵌合双特异性”又正式收到cFDA颁发的临床批件。

双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，能在靶细胞和功能分子(细胞)之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，是基因工程抗体的一种，现已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。本文针对双特异性抗体的设计方案进行了简单汇总。

 IgG形态的双特异性抗体（BsIgG）

BsIgG是最常规的将两个不同靶点的单价抗体组合而成的IgG形态的双特异性抗体。这类抗体的方案设计上，若将两条不同的轻链和两条不同重链共表达于同一个细胞中，轻链和重链之间会出现多达9种错配，因而目的形态的BsIgG纯化困难，产量较低。目前该型式已上市双特异性抗体的典型代表是catumaxomab (anti-CD3 × anti-EpCAM)，在欧盟获得批准用于治疗EPCAM阳性肿瘤的恶性腹水患者。

目前解决错配及纯化的方案有如下几种：1）通过proteinA与离子柱等结合纯化；2）在CH3处分别设计“knobs” (T366W)和“Hole” (T366S, L368A, and Y407V)的突变，通过“knobs-into-Hole”的策略避免重链错配；3）改造重链恒定区，使其分别带正点和负电，造成异电相吸；4）使用通用性的轻链，避免轻链错配；5）在两个宿主细胞中分别表达两种抗体，并在体外重新组装；6）在轻链上设计“knobs-into-Hole”或者分别带正负电荷；7）CH和CL不变，只改变VH和VL区域等。

附加在IgG形态上的双特异性及多特异性抗体（Appended IgG）

Appended IgG是在IgG的氨基端或羧基端通过短肽连接额外的抗原结合单元而形成的双特异性抗体（包括VL、VH、Fv或scFv等）。此类抗体具有更强的抗原结合活性，可确保不同目的抗原的同步结合，同时适用于细胞因子等低丰度的蛋白的结合。该类型中已取得临床研究进展的有双可变结构域Ig（DVI-IgG），是将两个抗体的可变结构域串联在一起形成双特异IgG样分子。DVD-IgG的每个Fab结合两个靶标。这个技术可以避免不同的重链或轻链的错配，同时提高生产的重复性、产量和稳定性，而且含有Fc结构域便于纯化。

 双特异性抗体片段（BsAb fragment）

此类抗体缺少抗体的部分或者全部的恒定区，许多BsAb fragment利用短肽将重链和轻链连接起来，以便其在一个宿主细胞中表达。BsAb fragment包含多种形式，scFv是通过VH-VL或者VL-VH的构建形式进行表达，VH和VL之间1-10个氨基酸长度的短肽能促进VH和VL的链内交联而避免链外交联，同时可变区的排列顺序有时会影响其表达；Diabody是将两个scFv片段进行共表达，其连接形式可通过“knobs-into-Hole”模型、C末端二硫键、短肽串联等方式；DART则是将两个单价scFv重新组合成两个异源scFv，并在末端引入二硫键，共表达与同一宿主细胞中，最终折叠成双价scFv。其他形式的BsAb fragment见上面的模型图。

BsAb fragment穿透力强，但其半衰期短，因此其给药频率往往增加。

 双特异性抗体与蛋白融合 

双特异性抗体同样能与蛋白融合以增加其特异性或其他功能。例如ScFv与HSA融合能够延长半衰期，HSA能够与FcRn结合而不改变抗原结合力。ScFv-HSA不仅增加分子的大小，促进BsAbs的再循环，延长半衰期。被细胞吸收的HSA首先结合早期溶酶体的FcRn，避免降解，然后HSA重新定位在质膜上，重新释放到血清中。Dock-and-Lock（DNL）模型的双特异性抗体赋予其更高的价位，DNL中其中一个含1个巯基的Fab末端通过Dockingdomain形成同源二聚体，同源二聚体复合物与另外一个含2个巯基的Fab末端的Anchoring Domain结合，同时2对巯基形成共价键，最终形成稳定的DNL型BsAb。

 通过化学键连接的双特异性抗体 

在BsAb的重组表达方法出现之前，BsAb开发最为成熟的方法是将抗体或抗体片段通过化学键来连接。第一个报道的此类抗体是将两个兔源的IgG抗体通过胃蛋白酶消化形成2个Fab’片段，进一步进行还原和氧化连接成BsF(ab’)2抗体。此后其连接手段优化为半胱氨酸连接。Cov-X-Body是BsAb Conjugates设计方法的一次革新，它将小分子药物连接到2条Fab臂的赖氨酸上，延长了小分子的半衰期。进入临床I期的CVX-241就是采用这种方法将VEGF和 Ang2的小分子抑制剂连接到了Fab臂上，后因其药效不明显而终止。

参考文献：

Alternative molecular formats and therapeutic applications for bispecific antibodies.