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很多人不知道，抗体药物研发，最关键的一步是。。。
咨询，问对人很重要
一个双特异性抗体药与普健的故事，四年征程，未完待续。。。
那是风和日丽的一个下午，叮咚~
一条消息跳了出来，“要开发双特异性抗体药物，你们有专家吗？”
“我们的抗体药物专家经验丰富，曾经成功开发过上市治疗性抗体药物，可以针对具体需求进行个性化设计。AtaGenix将全程为您服务。”
随后，一项历时四年的工程由此展开。
目标：开发一种双特异性抗体药物，通过连接CD3抗体，增强针对某类特定肿瘤细胞A的免疫系统识别能力。
要开发双特异性抗体，我们得先分别获得抗单种抗原的鼠单抗---CD3抗体和肿瘤抗原A的抗体。然后进行双特异性抗体设计、表达及纯化，对正确组装后的双抗进行检测，最终实现大规模生产。
路得一步一步走，每一步都很关键。
这就需要我们的单克隆抗体开发技术（点击可查看技术详情）。
已知目标蛋白在哺乳动物表达系统里很难表达，但我们就是解决困难的。
接下来，沿着单克隆抗体开发流程，看一下我们是怎样做到的。
经过预测和评估，我们选择了目标蛋白的一个片段在哺乳动物细胞中进行表达。
虽然，该基因是针对哺乳动物细胞表达而设计和优化的。
但是，我们向来不只做单一准备，永远备有为客户准备的Plan B。So，除了哺乳动物细胞表达系统，我们还选了大肠杆菌作为备用系统。两种表达方案同时进行，最终获得满足条件的抗原。
用原始抗原免疫五只小鼠，并筛选阳性血清。
为了筛选到符合要求的抗体，我们将绿色荧光蛋白GFP与抗原蛋白在哺乳动物细胞中融合表达，通过FITC信号将表达GFP的细胞筛选出来，作为流式分析抗体特异性的阳性细胞；并使用能够识别GFP的一抗作为阳性抗体对照，来筛选特异性抗体。
流式分析检测结果(GFP抗体和GFP阳性细胞百分比)：
流式检测中对抗原免疫原性最强的为3号小鼠血清，4号次之，我们决定对小鼠3号和4号进行融合。
将筛选出的两只小鼠脾细胞分别进行融合、亚克隆，FC检测保留最佳阳性抗体，最终获得最佳的30株抗肿瘤抗原A候选单克隆抗体杂交瘤细胞株。
看一下我们都做了哪些工作☟
a. 对3号小鼠细胞融合后的上清，进行ELISA检测，从中筛选出42株阳性细胞株（下表）。
b. 对3号小鼠细胞融合后的上清，进行FC检测，从中筛选出14株阳性细胞株（下表）。
c. 生产的抗体，进行FC检测，从中筛选出30株阳性细胞株（下表）。
小结
经过多系统表达测试，我们成功地在哺乳动物细胞中重组表达了目标抗原，开发出对抗原具有良好亲和力和特异性的单克隆抗体。最终，我们生产并纯化得到了30株抗肿瘤抗原A抗体的单克隆细胞株，产生的抗体均可以在流式细胞术中成功识别抗原。
抗肿瘤抗原A杂交瘤测序获得鼠单抗的VH和VL序列。
做了8个嵌合抗体的表达纯化，将8个嵌合抗体和1个原始杂交瘤细胞纯化得到的抗体进行ELISA验证，用Biacore检测了这9个抗体的亲和力，筛选到了高亲和力的嵌合抗体。
表达了18个人源化抗体，将18个人源化抗体、原始杂交瘤细胞纯化得到的抗体及筛选得到的最佳嵌合抗体，进行ELISA验证，用Biacore检测了这20个抗体的亲和力，筛选得到高亲和力抗体。
接下来，是最关键的一步。别眨眼哦！
目标：抗肿瘤抗原A和CD3的双特异性抗体
我们已获得3个抗肿瘤抗原A抗体，1个抗CD3抗体。
AB1（前期项目中开发并测序的小鼠杂交瘤单克隆抗体）
AB2和AB3（通过噬菌体展示开发的人源单克隆抗体）
AB4 （AB4h）是在专利中公开的的抗CD3人源化抗体
我们的抗体设计专家设计了3种类型的双特异性抗体，即CrossMAb，IgG-like format using DuoBodies，and IgG-like bivalent Fab-Fab-Fc format。
将cDNA序列亚克隆到AtaGenix特有的哺乳动物细胞表达载体pTXs1中，本项目共使用21个表达质粒（下表）：
总共16种抗肿瘤抗原A和抗CD3的重组抗体片段用于测试。
表达测试结果如下：
CrossMAbs类型重组抗体表达纯化测试
结果表明，CrossMAbs是表达的，但没有以完整的双特异性抗体结构组装，处于半形成状态。
DuoBodies类型重组抗体表达纯化测试
No.7: AB1重组抗体；No.8: AB2重组抗体；No.9: AB3重组抗体；No./10: AB4重组抗体
Bivalent Fab-Fab类型重组抗体表达纯化测试
重组抗体QC结果（还原胶和非还原胶）
结果显示，对于DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗体类型，正确地产生了完整的双特异性抗体结构。
值得一提的是，我们整个表达纯化过程对内毒素进行了有效的控制和去除，将内毒素控制在<0.1EU/mg。
上面获得的DuoBodies类型重组抗体，目前只能特异识别单一抗体，如何将两种抗体组合连接，就需要神奇的Fab臂交换技术。
通过特定的条件，进行Fab臂交换重组抗肿瘤抗原A抗体和抗CD3抗体，形成双特异性抗体。
对交换重组的双特异性抗体进行检测：
重组DuoBodies抗体QC结果（还原胶和非还原胶）
1：No.7+No./10；2：No.8+No./10；3：No.9+No./10
重组DuoBodies抗体产量及纯度
5.1）SEC-HPLC Analysis
SEC-HPLC检测结果表明，No.7+No./10重组双特异性抗体浓度最高，是由两个重链和两个轻链组成的理想杂合四聚体。No.8+No./10重组抗体有一些降解或未组装完全，No.9+No./10重组抗体显著降解或组装较少。
5.2）ELISA滴定
ELISA滴定法同时测定双特异性抗体和以前获得的亲本抗体(AB1、AB2和AB3)对肿瘤抗原A和CD3的结合能力。
针对肿瘤抗原A结合检测
针对CD3结合检测
检测结果显示，所有阳性对照与预期一致。
DuoBodies和Bivalent Fab-Fab抗体与肿瘤抗原A和CD3结合良好，说明这两类重组双特异性抗体构建正确。虽然CrossMAbs类型抗体也会结合，但它们的结合很可能是由半合成状态的抗体造成的。
项目的顺利推动，其中包含2000多封邮件沟通，30多个技术人员辛勤实验，历时4年，中法科学家通力合作。
目前，其中一个双特异性抗体已经完成开发，生产并交付客户1.237g抗体。接下来，客户计划采用我们拥有自主知识产权的细胞株进行稳定细胞株构建，后续事宜正在商定中。
