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免疫沉淀(姊妹篇):常见问题&解决方案

发表时间:2023-01-31 访问次数:387
免疫沉淀技术可以与基因组技术、放射同位素技术、聚合酶链式反应、免疫印迹等实验方法相结合,对较复杂的蛋白质与DNA/RNA的关系和定位提供非常好的解决方法。先了解这几种方法的区别:
种类 研究对象 结合技术

染色质免疫沉淀

(CHIP)

DNA-蛋白质 PCR

蛋白质免疫沉淀

(PIP)

抗原-抗体 蛋白免疫印迹

放射免疫沉淀

(RIP)

抗原-抗体 放射性同位素技术

当然,再结合其他技术还可以衍生出更多的技术,本篇先来剖析一下染色质免疫沉淀(CHIP)。

CHIP

染色质免疫沉淀 (ChIP) 是研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。其原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。后期通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

应用:ChIP可以用来检测体内反式作用因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,ChIP与其他方法的结合扩大了其应用范围:ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;ChIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。

操作也可以很简单
1

甲醛处理细胞

2

收集细胞,超声破碎

3

加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合

4

加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,沉淀

5

对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合

6

洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物

7

解交联,纯化富集的DNA-片断

8

PCR或基因芯片分析

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翘首以待实验成果

然后有人欢喜有人忧

怎么把“惊吓”变成“惊喜”

this is a question

只要找到破解方法,

所有的问题都不是问题!

今天我们就来一一击破

免疫沉淀系列实验中那些揪心的问题。

 
1 WB结果背景高且不均匀
原因 方案
洗涤不充分 离心前盖上管盖反复颠倒几次
抗体浓度太高 检查推荐抗体用量,尝试使用更少的抗体
抗体特异性不够 使用亲和纯化的抗体,最好预先吸收
封闭不充分 优化封闭时间/温度,室温封闭1小时或4℃封闭过夜
封闭液中与其他蛋白发生抗体的交叉反应 换一种不同的封闭液;不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭,牛奶含生物素
操作设备被污染 保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁,无外源污染物
 
2 WB结果信号弱或无信号
原因 方案
蛋白未转到膜上 可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流
一抗、二抗等不匹配 选择针对一抗来源的种属抗体
过度封闭 使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶的抗体稀释液;试用不同的封闭液;减少封闭时间
洗膜过度 洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.05%的弱去垢剂Tween-20
曝光时间太短 延长胶片的曝光时间,超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时
 
3 杂带较多/特异性条带异常
原因 方案
细胞传代次数过多,蛋白表达模式分化 使用原始或传代少的细胞株或进行平行实验
样本处理过程中目的蛋白发生降解

使用新鲜制备的标本并使用蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作

一抗不纯 使用单克隆或亲和纯化的抗体,减少非特异条带
一抗特异性不高 重新选择或制备高特异性的抗体

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小编更希望你们实验开挂,这些问题统统木有!