种类 | 研究对象 | 结合技术 |
---|---|---|
染色质免疫沉淀 (CHIP) |
DNA-蛋白质 | PCR |
蛋白质免疫沉淀 (PIP) |
抗原-抗体 | 蛋白免疫印迹 |
放射免疫沉淀 (RIP) |
抗原-抗体 | 放射性同位素技术 |
当然,再结合其他技术还可以衍生出更多的技术,本篇先来剖析一下染色质免疫沉淀(CHIP)。
染色质免疫沉淀 (ChIP) 是研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。其原理是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物,并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段,然后通过免疫学方法沉淀此复合体,特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。后期通过对目的片断的纯化与检测,从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
应用:ChIP可以用来检测体内反式作用因子与DNA的动态作用,还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。而且,ChIP与其他方法的结合扩大了其应用范围:ChIP与基因芯片相结合建立的ChIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;ChIP与体内足迹法相结合,用于寻找反式因子的体内结合位点;RNA-ChIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。
甲醛处理细胞
收集细胞,超声破碎
加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合
加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,沉淀
对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合
洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物
解交联,纯化富集的DNA-片断
PCR或基因芯片分析
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翘首以待实验成果
然后有人欢喜有人忧
怎么把“惊吓”变成“惊喜”
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只要找到破解方法,
所有的问题都不是问题!
今天我们就来一一击破
免疫沉淀系列实验中那些揪心的问题。
原因 | 方案 |
---|---|
洗涤不充分 | 离心前盖上管盖反复颠倒几次 |
抗体浓度太高 | 检查推荐抗体用量,尝试使用更少的抗体 |
抗体特异性不够 | 使用亲和纯化的抗体,最好预先吸收 |
封闭不充分 | 优化封闭时间/温度,室温封闭1小时或4℃封闭过夜 |
封闭液中与其他蛋白发生抗体的交叉反应 | 换一种不同的封闭液;不要用含抗生素蛋白的牛奶封闭,牛奶含生物素 |
操作设备被污染 | 保证电泳仪器、印迹仪器和孵育用容器清洁,无外源污染物 |
原因 | 方案 |
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蛋白未转到膜上 | 可以用丽春红染膜并结合染胶(考马斯亮蓝)后确定条带是否转至膜上或转移过头;适当调整转膜的时间和电流 |
一抗、二抗等不匹配 | 选择针对一抗来源的种属抗体 |
过度封闭 | 使用含0.5%脱脂奶粉或无脱脂奶的抗体稀释液;试用不同的封闭液;减少封闭时间 |
洗膜过度 | 洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂不宜过强或过多,建议使用0.05%的弱去垢剂Tween-20 |
曝光时间太短 | 延长胶片的曝光时间,超感应化学发光底物会持续发光至少6个小时 |
原因 | 方案 |
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细胞传代次数过多,蛋白表达模式分化 | 使用原始或传代少的细胞株或进行平行实验 |
样本处理过程中目的蛋白发生降解 |
使用新鲜制备的标本并使用蛋白酶抑制剂;样本处理时在冰上操作 |
一抗不纯 | 使用单克隆或亲和纯化的抗体,减少非特异条带 |
一抗特异性不高 | 重新选择或制备高特异性的抗体 |
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