别问蛋白有多少，掌握定量方法再来说

蛋白定量

蛋白定量即蛋白质定量，蛋白质定量根据其目的分为蛋白质的“总定量”和特定蛋白质的“个别定量”。蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分，为验证细胞裂解是否成功，或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存，需对细胞裂解液进行蛋白定量；为了判定蛋白的产量，需对纯化好的蛋白进行定量；为了将纯化好的蛋白用生物素或报告酶进行标记，同样需要首先对蛋白样品进行定量，以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。

 

蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它种类繁多，结构不一，功能各异，分子量相差很大，因此建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析方法很因难。

现测定蛋白质含量的方法有很多：根据物理性质来分有紫外分光光度法；根据化学性质来分有凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法（Lowary法）、BCA法和胶体金法；根据染色性质有考马斯亮蓝染色法、银染法；根据其他性质有荧光法；其中较为常见的有以下五种。

 

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紫外分光光度法

 

蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280 nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与蛋白浓度成正比，故可作为蛋白质定量测定的依据。该方法是最快的蛋白质定量方法，但由于各种蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量不同，如要准确定量则应有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或者知道其消光系数作为参考。另外，不少杂质在280 nm波长下也有—定吸收能力，可能发生干扰，其中核酸(嘌呤和嘧啶)的影响尤为严重。核酸的最大吸收峰是在260 nm，因此若溶液中存在核酸，必须同时测定OD₂₆₀与OD_280，然后根据两种波长的吸收度比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。 

优点

操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化蛋白质的微量测定。

缺点

（1）当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，会产生—定误差。

（2）混有核酸时必须分别测定280 nm和260 nm两处的OD值，再按公式推算蛋白质含量。

 

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双缩脲法

 

双缩脲（NH₃CONHCONH₃）是两个分子脲经180℃左右加热放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO₄形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能通过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10 mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

优点

较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

缺点

灵敏度差，常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质测定。

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考马斯（Comessie)亮兰结合法

 

考马斯亮兰结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法。考马斯亮兰能与蛋白质的疏水区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G250 的最大光吸收峰在465 nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰变为595 nm。在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复合物呈青色。在595 nm下，光密度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。

优点

（1）操作简便、快速；检测灵敏；重复性好。 

（2）显色迅速，约2分钟内可完成染料与蛋白质的结合，所现颜色至少在1小时内是稳定的。 

（3）与改良Lowary法相比，干扰物质较少。 

缺点

（1）当样品中存在较大量的SDS、TritonX-100等去垢剂时，显色反应会受到干扰。如样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色，故必须预先处理样品。 

（2）考马斯亮兰G250染液不宜久存，以1-2月为宜。 

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Lowary蛋白定量法

 

 

Lowary法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，在加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此，Lowary法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3-15倍，为双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。 

注意事项

（1）酚试剂只在酸性条件稳定，故当其加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前，还原反应即能发生。 

（2）为了保证反应进行完全，反应在25～30℃水浴中进行，反应30 min后准时比色。 

（3）避免还原物质干扰本实验。 

优点

微克级高灵敏度定量测定，稳定。

缺点

（1）受植物体内存在的酚类物质干扰。

（2）去污剂如TritonX-100，SDS，NP-40的浓度超过0.2%时会影响定量结果。

 

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BCA法

BCA( Bicinchoninic acid)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowary法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu²⁺络合并将Cu²⁺还原成Cu¹⁺。BCA与Cu¹⁺结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。

BCA蛋白定量法需要两种试剂：

试剂A：称取1 g sodium bicinchoninate，2 g Na₂CO₃，0.16 g酒石酸钠，0.4 g NaOH和0.95 g NaHCO₃，定容到100 ml，用NaOH将pH调到11.25。

试剂B：将0.4 g CuSO₄•5H₂O溶于10 ml水中。

工作液：100份试剂A和2份试剂B混合。

测量方法：取25 μl 标准品加入到200 μl BCA工作液中，37℃或60 ℃孵育30 min，检测562 nm处的吸光度绘制标准曲线。用同样的方法检测蛋白样品的吸光度可算出蛋白样品的浓度。

 

优点

（1）灵敏度高，检测浓度下限达到25 μg/ml，最小检测蛋白量达到0.5 μg，待测样品体积为1-20 μl。

（2）操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便。

（3）测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。

（4）在20-200 μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。

（5）检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝蛋白定量法。

（6）经济实用，除试管外，测定可在微板孔中进行，大大节约样品和试剂用量。

缺点

受螯合剂和略高浓度的还原剂（EDTA小于10 mM，DTT小于1 mM，巯基乙醇低于1mM）的影响。

 

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以上是针对全蛋白质的“总定量法”，然而许多实验需要对溶液中特定蛋白进行定量分析，即针对特定蛋白质的“个别定量”。针对特定蛋白定量常用的方法有酶联免疫吸附试验法（ELISA），免疫印迹分析法（WB）和质谱检测（MS）。

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ELISA

 

 

ELISA是溶液中特定蛋白定量的一种常用方法，通常是在96孔板上进行，关键步骤是特定抗原/蛋白的固定。具体来说，ELISA有不同变种。

直接或间接ELISA

特定抗原/蛋白直接吸附到检测板，封闭未被抗原包被的孔板表面，然后在孔板中加入酶标（直接ELISA）或未酶标（间接ELISA）的第一抗体，在测试孔板中，一抗与抗原/蛋白相结合。对于未酶标的第一抗体，加入酶标的第二抗体与第一抗体结合。最后，加入酶底物（通常是四甲基联苯胺TMB或碱性磷酸酶ALP）使溶液发生颜色变化然后使用分光光度计检测。颜色变化与蛋白质浓度是直接相关的。

直接ELISA的优点是速度快，并且没有第二抗体的交叉反应问题，但局限是第一抗体的标记可能是费时和昂贵的。此外，信号放大是最弱的。因此，更常用的是

夹心ELISA

特定抗原/蛋白结合在孔板表面包被的第一抗体（捕获抗体）和酶标的第二抗体（检测抗体）之间，第二抗体比较容易买到，但可能会发生第二抗体的交叉反应。

任何ELISA测定蛋白质浓度的一个重要环节都是蛋白质标准曲线，通常是连续稀释已知浓度的蛋白质，从而绘制标准曲线。

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WB

 

WB只能半定量。通过凝胶电泳把原始或变性的蛋白质分开，把蛋白质转膜（硝酸纤维素或PVDF），然后使用特定的酶标抗体检测。最后，加入适当的底物（化学发光底物）产生可检测的信号。虽然WB比ELISA更费时，但是WB不仅可以对特定的蛋白进行定量，而且可以在实验中同时检测蛋白质修饰。

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MS

 

MS是蛋白质定量的新兴方法。在蛋白质组学分析中，除了蛋白定性之外，一个重要的步骤就是对特定的蛋白进行定量分析。MS定量蛋白的方法有很多。

• 常用的方法是较重的稳定同位素碳（¹³C）或氮（¹⁵N）加入到第一个样本（多肽或蛋白质），而相应的轻同位素（¹²C和¹⁴N）加入到第二个样本（内标），然后混合这两个样本进行分析。由于两个样本的质量差，用质谱分析仪测定的两个样本峰强度的比值就相当于其相对丰度比。

• 质谱蛋白定量的第二种方法，可以不用标记样本，即用基质辅助激光解吸/电离 - MALDI分析。

使用质谱这种通用方法可以在一次实验中同时进行定量和定性检测。但这种方法需要的检测仪器很昂贵，从而限制了该方法的使用。

 

总之，虽然测定蛋白质含量的方法很多，但还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。