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残余牛血清白蛋白（BSA）含量检测是生物制品质量控制的一项重要指标，直接关系到生物制品的使用安全。世界卫生组织及世界各国药典对残余BSA含量均有严格限定。《中国药典》（三部）2020版规定，成品中牛血清白蛋白残留量不得>50ng/剂。因此，需要利用特异性好，灵敏度高的抗体建立一种简便、高效的牛血清白蛋白残留量检测方法。
牛血清广泛使用于生物制品研究、制备过程中，虽然在生产过程中经纯化可以去除制品中大部分BSA,但微量BSA依然存在于生物制剂成品中。在人体中，超过一定浓度的BSA易引起人的免疫病理反应，引起严重的副作用，影响生物制品的安全性。普健生物基于客户需求，对BSA有更为严苛的控制标准，此前我们基于鼠抗开发平台开发出灵敏度为0.51ng/ml，可检测1.56-100ng/mL的BSA检测试剂盒。能满足现行药典规范BSA残留检测要求，并有了稳定的客户群体。但在后续的产品回访中，我们的项目经理进一步了解了客户的项目对BSA残留其实有更为严苛的控制标准，只是苦于市售产品检测限以及灵敏度未能完全满足。普健生物技术团队深挖客户需求，结合普健生物最新推出的XtenTMMab兔单克隆抗体开发技术，为客户提供了一种全新、高效、高灵敏度的BSA检测解决方案。
本公司利用兔单B细胞抗体开发技术，从BSA免疫的兔外周血中，分离BSA特异性的单B细胞，通过PCR 扩增及测序分析， 获得多个特异性识别BSA蛋白的抗体。
本方案筛选的兔单抗较传统方法杂交瘤技术筛选的抗体及兔多抗的亲和力和特异性更高，具有灵敏度高、稳定性强的特点，检测范围为0.78-50ng/mL，为开发高灵敏度的BSA残留检测试剂盒奠定了坚实的基础。
图1 普健生物XtenTMMab兔单克隆抗体开发流程
利用普健生物开发的快速免疫方法免疫新西兰大白兔，三免（Day21）血清效价大于128K，可以进行后续单B细胞流式分选。然后将从PBMC中分离筛选到的B细胞进行抗原特异性检测，阳性率大于60%。
|
抗原 |
BSA |
|
包被 |
1ug/ml*100ul |
|
2k |
4k |
8k |
16k |
32k |
64k |
128k |
PBS |
效价 |
|
|
三免血清效价 |
4.32 |
3.32 |
3.26 |
2.98 |
2.53 |
1.85 |
1.16 |
0.03 |
>128K |
图2 BSA兔血清三免（Day21）效价检测结果
图3 单B细胞ELISA检测部分结果展示
根据单B细胞ELISA检测结果，挑选12个克隆进行抗体基因测序及分析，12个克隆测序全部成功。
图4 抗体可变区基因分析结果
将测序得到的12个抗体挑选10个，利用普健生物自主开发的XtenCHO系统进行重组表达，纯化后得到纯度高，亲和力好的重组兔单抗。10株重组兔单抗ELISA效价均大于1:1000000。
图5 重组兔抗SDS-PAGE检测结果
图6 纯化后重组兔抗ELISA检测结果
将10株重组兔单抗进行方阵实验配对，得到多对灵敏度高的抗体对，优选其中一对, 标曲线性范围0.78-50ng/mL, R2=0.9992。
图7 BSA抗体对标准曲线
为了了解不同方法制备抗体亲和力的差异，我们将BSA的兔单抗与之前自产的用传统杂交瘤制备的BSA鼠单抗进行了亲和力的测试。在此，我们利用OPENSPR将鼠单抗、兔单抗和BSA进行了亲和力检测，发现兔单抗的亲和力比鼠单抗高1-2个数量级。
| ka(1/Ms) | kd (1/s) | KD (M) | |
| BSA&兔抗3D5 |
2.21E+05 |
1.90E-05 |
8.61E-11 |
| BSA&兔抗6B7 | 1.39E+05 | 7.49E-06 | 5.38E-11 |
| BSA&鼠抗1 | 2.81E+04 | 1.39E-04 | 4.95E-09 |
| BSA&鼠抗2 | 1.48E+05 | 2.02E-05 | 1.36E-10 |
剩余未分选的B细胞以及筛选阳性的其他单B细胞可以冻存，以便用于后续筛选其他应用需求的抗体。
如果您对我们的单克隆抗体开发技术服务感兴趣,您可以直接点击阅读原文或点击文字链接，实时与我们项目经理沟通！服务咨询电话：027-87001869
普健生物依托自主研发的高通量活性蛋白表达系统，Single B细胞抗体发现技术平台，噬菌体展示抗体库技术和杂交瘤抗体开发平台，抗体表达、抗体人源化和稳定细胞株构建平台，与各研究机构展开技术服务项目合作，助力IVD检测、疫苗生产、重组抗体开发。
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