联系我们
用于分子诊断和疾病的单克隆抗体
广泛应用于抗原检测和人类疾病的抗体因其高度特异性和低毒性使成为了极具前景的医药商品。实际上，它们是仅次于疫苗的第二大临床开发生物药品类别。自1997年FDA批准首个抗体药——抗cd20嵌合抗体利妥昔单抗以来，利妥昔单抗已成为许多非霍奇金淋巴瘤治疗策略的组成部分。
单克隆抗体通常通过用抗原免疫实验动物(如小鼠)获得，筛选得到一株产生特异性抗体的杂交瘤。杂交瘤技术是最常用的单克隆抗体制备技术之一，但由于实验动物免疫系统存在偏差，这限制了获得针对保守哺乳动物蛋白的高亲和力抗体的能力。尤其是在应用于针对人类的治疗性抗体的领域，这些蛋白质的异源性通常使它们对人类具有免疫原性，从而引发HAMA反应(人类抗小鼠抗体)。
抗体人源化绕开了这一瓶颈，通过用人框架同源序列替换小鼠序列来最大限度地减少HAMA应答。人源化抗体已成为当今许多疾病治疗的现实，包括癌症的治疗和诊断。然而，一些应用可能会受到其分子大小的限制。它们对组织(如实体瘤)的穿透性较差，并且通过空间约束与某些分子表面的功能重要区域结合较差或不结合。抗体片段，如Fab(片段抗原结合)，scFv(单链可变片段)是减少抗体大小和增加其渗透到组织的替代方案，纳米抗体的出现完美解决了这一难题。
构建和筛选丝状噬菌体表面人源抗体组合文库是获得人源抗体及其片段的适宜方法。这些文库可以是合成的，也可以从人类患者的库中获得，结合物的选择是针对之前定义的配体，从而产生完全人源性抗体片段，理论上的免疫原性低于鼠源或人源化抗体片段。抗体噬菌体展示技术为研究、诊断和治疗提供了大量的人源重组抗体。2003年，FDA批准了第一种噬菌体展示抗体阿达木单抗(Adalimumab)用于类风湿性关节炎。目前，它还广泛用于银屑病、关节炎、强直性脊柱炎和克罗恩病。接下来我们将主要梳理来自幼稚细胞或免疫文库的Fab、scFv、sdAb或其他抗体片段的例子。
抗体噬菌体展示库
噬菌体展示技术由George P.Smith于1985年提出，描述外源肽在噬菌体颗粒表面的呈现。这是基于观察到，来自Inoviridae家族的噬菌体(M3,fd,fl)经过适当包装，即使在外源肽与其衣壳蛋白融合的情况下仍保持感染性。通过基因操作获得噬菌体展示文库。数以亿计的肽、蛋白变体、抗体片段编码基因被克隆到一个融合到丝状噬菌体外壳蛋白(pIII或pVIII)基因5'的载体中。这些噬菌体库被用来转化细菌，这些细菌也会被辅助噬菌体感染。辅助噬菌体感染使病毒颗粒在其表面显示融合蛋白。由于外壳蛋白仅为展示肽提供锚定，因此不应干扰其结构，并允许肽及其相应基因的亲和纯化。这一原理也适用于抗体片段在丝状噬菌体表面的呈递。
可以采用不同的策略获得抗体组合噬菌体展示文库。根据人类可变轻库(VL)和可变重库(VH)构建了一些合成或半合成文库。最常用的是Griffin-1文库，它由体内使用的大部分人类VH和VL基因片段组成，使用合成的寡核苷酸产生更多的CDR3多样性(半合成)，以及Tomlinson I文库，它由单一的人类框架组成，多样性包含在VH和VL结构域的18个氨基酸位置，主要位于抗原结合位点(合成)。在这两个库中，抗体均显示为scFvs。从这些文库中获得了几种人抗体，单独或联合用于生物淘洗工艺。另一种策略是通过扩增一个或多个个体的可变基因库来构建文库。为此，我们使用了覆盖所有V基因家族的引物，文库由VL和VH链编码基因随机组合而成。同样，抗体编码基因被组装成Fab或scFv抗体片段。从理论上讲，每个克隆都编码一个特定的抗原结合位点，该位点来自于通过人工结构域外推原始结构域而增加的自然结构域。
淘选过程在体外模拟了B细胞克隆筛选系统，方法是特异性富集具有所需特异性抗体的噬菌体颗粒。在建库过程中，确保库的多样化是很重要的，因此库的大小对于尝试为任何特定抗原选择结合形式的有效性是至关重要的。组合抗体库可以从免疫或未免疫的供体中构建。可选择提供针对不同类型抗原的高亲和力抗体:半抗原、蛋白质、多肽和碳水化合物
筛选方法大多基于4个主要步骤:制备噬菌体展示文库，吸附特异性结合噬菌体，去除非特异性或低亲和力噬菌体，回收目标结合物，细菌感染后再扩增，进行下一轮筛选。筛选过程导致噬菌体与所选的纯或不纯抗原特异性结合的顺序富集。这些筛选步骤将重复3-5次，直到鉴定出高特异性/亲和力的结合物。
普健生物噬菌体展示抗体发现平台具有强大的筛选能力，满足高通量抗体开发需求，拥有包括随机肽库、免疫库和天然库在内的千亿级库容，可以构建多物种（人源、小鼠、兔子、羊驼等）抗体文库以及多种类型（scfv、Fab、VHH 等）的抗体文库。
选择细胞表面的噬菌体是发展肿瘤靶向治疗的重要一步。它为获得针对未知和非免疫原性细胞表面抗原的抗体提供了机会。随着靶抗原越来越复杂，如细胞表面，选择过程变得更加困难。细胞膜上有大量的蛋白质、碳水化合物和脂类作为潜在抗原。它们的表达水平可因细胞而异，这使得相关抗原在所有细胞膜成分中存在的量很小。因此，每一轮的选择都需要相对大量的细胞，这使得该技术对于通常从器官和组织中获得的小细胞群的应用变得困难。但噬菌体展示文库在这里就体现出了强大的应用前景。
普健生物噬菌体文库的类型
随机肽库：将化学合成的随机寡核苷酸序列与噬菌体的表面蛋白基因融合，在噬菌体表面表达出各种氨基酸组合的 随机序列短肽。利用噬菌体展示随机肽库可以高通量筛选各种抗原的抗原表位
免疫库：免疫库由经过免疫 ( 包括疫苗注射、微生物感染、自身免疫疾病、肿瘤等 ) 后的供体 B 淋巴细胞的抗体 基因构建。对于特定免疫抗原的抗体淘选的效率较高，但一般仅适用于一种特异性抗体的选择，库容量要求不高，一般
106-108的库容量就可满足需要
天然库：采用不经免疫的人或动物来源的外周血淋巴细胞、骨髓、脾细胞的 B 细胞作为材料，进行基因扩增，但亲 和力通常较低。骨髓内和骨髓外所有抗体基因都包含在内，所构建的抗体库适用于所有抗原所对应的抗体的选择，库容 量要求较高，最小需要达到 109 ，因为目前估算的自然界的抗原种类在这个数量级上
普健生物噬菌体展示技术平台优势
1. 丰富的噬菌体抗体技术经验，五年以上噬菌体抗体开发，交付上百个噬菌体展示抗体开发项目
2. 具有全人源重组抗体库，库容高达千亿级别（1011 pfu)，两步建库法，保证了文库的多样性，抗体库片段插入
正确率高；可以两周拿到全人源重组抗体
3. 可以构建多物种（人源、小鼠、兔子、羊驼等）抗体文库
4. 可以构建多种类型（scfv、Fab、VHH 等）的抗体文库
噬菌体展示技术为快速发现肿瘤抗原抗体提供了有力的手段。它容易实现，操作方便，成功率高。与小鼠杂交瘤技术产生的抗体相比，噬菌体展示技术抗体的优点是直接分离出全人源抗体，而小鼠杂交瘤技术需要费力地将候选引物人源化。目前，许多噬菌体展示抗体已进入生物制药市场。单克隆抗体通过调节固有的肿瘤细胞通路和激活针对肿瘤细胞的固有免疫反应，已成为标准的抗癌药物。显然，噬菌体展示技术衍生的人类抗体可以与早期产品竞争，只要它们针对的是明确定义的靶点，如EGFR或VEGF通路。噬菌体展示技术在药物研发中发挥着重要作用，许多噬菌体分子已获得FDA批准，许多噬菌体分子已进入临床试验。我们可以期待，在不久的将来会有更大的改进，噬菌体展示将为肿瘤学带来更多的贡献。
参考文献：
Chinestra, P.; Lajoie-Mazenc, I.; Faye, J.C.; Favre, G. Use of phage display for the identification of molecular sensors specific for activated Rho. Meth. Mol. Biol 2012, 827, 283–303. [Google Scholar]
Glokler, J.; Schutze, T.; Konthur, Z. Automation in the high-throughput selection of random combinatorial libraries—Different approaches for select applications. Molecules 2010, 15, 2478–2490. [Google Scholar]
Pereira, S.; Maruyama, H.; Siegel, D.; van Belle, P.; Elder, D.; Curtis, P.; Herlyn, D. A model system for detection and isolation of a tumor cell surface antigen using antibody phage display. J. Immunol. Meth 1997, 203, 11–24. [Google Scholar]
Carmela Dantas-Barbosa;Marcelo De Macedo Brigido; andAndrea Queiroz Maranhao;Antibody Phage Display Libraries: Contributions to Oncology.Int. J. Mol. Sci. 2012, 13(5), 5420-5440;
