抗体是由高等生命形式的免疫系统中的B细胞制造的蛋白质,作为一种适应性特征,使身体能够处理对生物体构成威胁的入侵外来分子。抗体的自然功能涉及它们附着在抗原(属于入侵的异物)上,以标记它们被免疫系统破坏。
这种附着在特定分子上的天生倾向已经确立了它们在科学研究中的用途。由于可以选择已知会附着在某些抗原上的特异性抗体,因此研究人员可以使用抗体来识别某些物质的存在。因此,在细胞蛋白质功能的研究中,抗体的使用变得非常依赖。
科学家们已经开发出许多利用抗体性质来研究细胞和组织中蛋白质的技术。免疫组织化学、免疫细胞化学、蛋白质印迹、ELISA、流式细胞术和FACS以及ELISPOT等应用都是利用抗体的成熟方法。为了充分利用这些强大的研究技术,必须选择适合特定应用的正确抗体,因此,为您的实验研究选择合适的抗体是第一步也是尤为重要的一步。
免疫组织化学具有低至中等通量,可用于固定细胞和组织,可以产生细胞定位,具有高空间分辨率,通常专注于单个蛋白质,可以一次对多种蛋白质进行成像,并且是定性和半定量的。
研究定位的另一种技术是免疫细胞化学。该技术具有低到高通量,可用于固定细胞和组织,可以产生亚细胞定位,可以一次对多种蛋白质进行成像,并且是定性和半定量的。然而,其空间分辨率受到组织结构的限制。
蛋白质印迹是研究蛋白质浓度的合适技术。它具有低到中等通量,可用于细胞和组织裂解物,产生相对蛋白质水平,可以建立分子量,亚型和翻译后修饰,并且是半定量的。
ELISA是研究蛋白质相互作用的合适技术。该方法具有中到高通量(96孔板),可用于研究血清/血浆,活或固定细胞和组织,它产生准确的蛋白质水平,它是定量和定性的。
ELISA也可用于研究表达,其特征如上所述。流式细胞术和FACS是研究表达的替代技术。它具有从低到高通量(最多384孔板)。它可用于固定或活细胞,可以确定化学和物理性质,如大小、表面标志物的表达等。它可用于定量和分选细胞(FACS)。最后,它是一种定量方法。
选择一抗
选择一抗时,必须考虑正确的类型,单克隆或多克隆。
单克隆抗体仅识别抗原上的单个表位,它们产生的背景噪音较小,因为它们不太可能与其他蛋白质发生交叉反应。此外,它们的同质性非常高,这意味着批次之间的变异性很低。它们在与相关分子混合物中的抗原结合方面也非常有效。然而,由于它们太具体,它们不能在各种物种中工作。它们也容易受到抗原化学处理的表位丢失的影响。
另一方面,多克隆抗体的特征如下:它们识别任何一种抗原上的多个表位,它们具有高亲和力,可以帮助放大来自低表达蛋白的信号,它们更耐受抗原的微小变化,并且它们可用于检测来自免疫原性以外的物种的蛋白质。然而,缺点是它们容易出现批次间的差异,并可能产生背景信号。
选择二抗
所使用的方法类型将告知哪种二抗是合适的。
-IHC:HRP或AP偶联、片段、生物素化(亲和素/链霉亲和素与酶或荧光染料偶联)、荧光染料(如AlexaFluor®、Cy染料、FITC®和PE)以及预吸附。
-ICC:片段抗体,生物素化(亲和素/链霉亲和素与荧光染料偶联),荧光染料,FITC和PE,并预吸附。
-蛋白质印迹:HRP或AP偶联、生物素化(亲和素/链霉亲和素与酶偶联)、荧光染料(Alexa680和Alexa790)、轻链特异性抗体VeriBlotforIP。
-ELISA和ELISPOT:HRP或AP偶联,生物素化(亲和素/链霉亲和素与酶偶联),单克隆(特别是亚型特异性抗体,如抗IgG1)
-流式细胞术和FACS:荧光染料,Cy染料、FITC®和PE、生物素化(亲和素/链霉亲和素与荧光染料偶联)、单克隆、F(ab')2片段和偶联一抗,可最大限度地提高时间效率。
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