包涵体纯化试剂盒

概述(Summary)icon

产品货号

ATO00034

产品描述(Description)

包涵体是指超表达的蛋白在细胞胞浆内或膜间内凝集形成的无活性的固体颗粒。包涵体形成的主要原因在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白折叠辅助因子，或环境不适导致无法形成正确的蛋白次级键。由于包涵体主要由超表达的重组蛋白质组成，因此分离纯化包涵体是分离纯化具有活性的重组蛋白的第一步。本公司生产的包涵体纯化试剂盒用于快速纯化包涵体得到可溶蛋白，无需繁琐变复性即可用于后续实验。

储存条件(Storage)

常温保存，保质期一年。

Note

For research use only .

使用方法(Standard Operating Procedure)icon

1.收集包涵体

(1)离心收集培养好的菌液。

(2)加入10ml(建议体积为1/20的菌体培养体积)的Buffer P1悬浮菌液(建议一次处理200ml菌液)。

(3)冰浴下超声，破菌 8s，间隔 8s，80 次(频率 200Hz 以上).

注意：此步骤需低温，快速。

(4)立刻加入蛋白酶抑制剂PMSF等。

(5)4℃，10000g离心10min，收集包涵体。

2.包涵体纯化

2.1蛋白包涵体表达量高时，可按以下步骤快速获得大量可溶的重组蛋白

注：使用前请将10 × Buffer P2母液按照1:10稀释成工作液，再进行如下操作：

(1)包涵体用10ml的Buffer P2重悬。

(2)4℃，10000g离心10min，收集包涵体。

(3)重复以上两步操作 3-6次。(该步骤建议段时超声处理离心后结块的包涵体，充分洗涤，能有效提高最终包涵体纯度)

(4)弃上清，倒扣吸干残液。

(5)加入2ml的P3 充分溶解包涵体(根据包涵体的量可适当调整dP3使用体积)，如有部分不溶解，超声处理或者适当提高P3用量。

(6)4 ℃，10000g离心10min，收集上清。

(7)更换终Buffer进行透析。(需自备，建议为TBS Buffer，pH 8.0)

(8)4℃，10000g离心10min，收集上清，即为所需蛋白。(如果蛋白出现大量沉淀，透析前终Buffer中加入1%体积的Buffer P5可有效减少蛋白损失)

2.2蛋白包涵体表达量低时，按以下步骤获得纯度较好的可溶的重组蛋白(以Ni柱亲和纯化为例)

(1)加入2ml的P3 充分溶解包涵体(根据包涵体的量可适当调整dP3使用体积)，如有部分不溶解，超声处理或者适当提高P3用量，然后加入等体积ddH2O。

(2)4℃，10000g离心10min，转移上清至干净的小管中。

(3)后续纯化过程同可溶蛋白纯化步骤。用Ni填料吸附蛋白，洗涤Buffer洗去杂蛋白，洗脱Buffer获得目的蛋白。洗涤Buffer和洗脱Bufferr中均添加1/10体积Buffer P4 有助于提高可溶蛋白得率。

(4)更换终Buffer进行透析。(需自备，建议为TBS Buffer，pH 8.0)

(5)4℃，10000g离心10min，收集上清，即为所需蛋白。(如果蛋白出现大量沉淀，透析前终Buffer中加入1%体积的Buffer P5可有效减少蛋白损失)

组分&说明(Component & Instruction)icon