自1975年Kohler和Milstein首次描述通过杂交瘤技术产生单克隆抗体(mab)的方法以来,单克隆抗体已成为必不可少的研究试剂和非常成功的治疗分子。由于疾病靶标在物种间的高序列保守性(使免疫变得困难)、受限的解剖位置(例如中枢神经系统)、难以纯化可溶性形式(例如gpcr)以及有时需要靶向疾病状态特异性的瞬时或不稳定构象,因此通过抗体干预来调节疾病靶标变得更具挑战性。
尽管杂交瘤方法已经彻底改变了单克隆抗体的使用,但由于依赖于融合事件,该技术相对低效。噬菌体展示技术也被广泛用作生产单克隆抗体的技术。然而,在文库构建过程中发生的抗体可变区基因的随机组合导致天然同源重链和轻链配对的丢失,而这些重链和轻链配对是在体内免疫应答过程中进化和选择的。由于这种随机配对,来自抗体文库的抗体通常需要体外成熟,以在作为治疗分子进展之前赋予增加的亲和力和稳定性。
近年来单B细胞技术获得了许多科学家的青睐,单B细胞技术平台保留了自然的重链和轻链配对,避免了低效的杂交瘤融合步骤,从而能够有效地挖掘免疫B细胞群。这有助于发现罕见的抗体,这些抗体可能具有独特的高度理想的特性,以及产生大量不同的抗体。在克隆抗体基因的过程中,保留天然的重链和轻链配对有利于产生具有吸引力的亲和力、特异性和稳定性的重组抗体。
流式细胞术已被用于从免疫、接种疫苗或感染后7天的献血者血液中分离出单个浆母细胞。在此期间,质母细胞短暂地出现在外周,并提供丰富的抗原特异性B细胞群供选择。然而,分选不包括抗原结合步骤,尽管群体丰富,但从这些浆质母细胞中回收抗原特异性重组抗体的比例可低至10%。
在相关的文献研究中,除了Manz等人以及最近的Carroll和al - rubeai[20]和Taddeo等人的研究外,流式细胞术尚未常规应用于抗原反应性IgG分泌细胞的鉴定。这主要是由于缺乏表面免疫球蛋白,排除了用靶抗原染色特定细胞的选择。然而,FACS已被成功用于鉴定抗原特异性记忆B细胞,表达表面IgG作为B细胞受体的一部分。Weitkamp等(2003)利用荧光病毒样颗粒(VLPs)在96孔板上鉴定并将轮状病毒特异性的人单B细胞分选到单孔中,然后进行培养,诱导抗体分泌。Amanna和Slifka设计了一种FACS方法,用于临床样本中破伤风和白喉抗原特异性记忆B细胞的鉴定和定量。然而,他们没有将其扩展到单细胞分选和进一步分析。di Niro等人描述了轮状病毒特异性B细胞分选后立即进行单细胞RT-PCR。
普健生物(我们)建立了噬菌体展示抗体文库技术平台以及新型的 Xten™ Mab Single B 兔单克隆抗体开发技术平台。利用B细胞分选富集策略,在流式分选设备的支持下,有效富集抗原特异性B细胞,提高B细胞体外培养的成活率,保留B细胞的多样性,可开发出不同应用需求的抗体。这些抗体具有多重优势:
高特异性:与小鼠和其他啮齿动物相比,兔免疫系统更优秀,产生的抗体特异性更强,亲和力更高
高稳定性:与常规小鼠生产的单克隆抗体相比,兔IgG结构稳定性高
高亲和力:兔的B细胞成熟过程产生的亲和力是啮齿动物的10-100倍
高多样性:兔拥有丰富的B细胞反应库,其产生的抗体在表位变异、突变、构象变化等方面优势显著,且多样性高
单B细胞筛选策略避免了杂交瘤融合和组合展示,已成为高效采集免疫动物和人天然抗体库的重要技术。使用一系列方法检测不同B细胞亚群是一种有吸引力的选择,可确保产生大量和多样化的高质量抗体组合。多种抗体的产生以及发现罕见的具有独特和理想特征的产生IgG的B细胞克隆的能力,有助于鉴定适合目的的分子,并可开发成治疗药物或研究试剂。