用于疾病的人源化抗体制备技术的发展

单克隆抗体（monoclonalantibody，mAb）B细胞产生的、由两条相同的轻链和两条相同的重链组成的Y形结构蛋白。其中抗原结合片段（antigenbindingfragments，Fab）由一条重链和一条轻链的6个互补决定区（complementarity-determiningregion，CDR）组成。Fab段决定了抗体结合抗原的特异性和亲和力；单抗的恒定区（Fc）通过结合细胞表面Fc受体来发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC）、补体依赖的细胞毒性作用（complementdependentcytotoxicity，CDC）等功能。

目前，治疗性单抗已广泛应用于癌症、自身免疫性疾病、传染病等多种疾病，为许多患者带来了全新的希望。但由于人抗鼠（humanantimouseantibody，HAMA）反应的存在，抑制了鼠单抗的临床应用，因此涌现了一系列抗体工程技术，如抗体人源化、噬菌体展示、转基因小鼠、单细胞PCR等技术，可以实现鼠单抗人源化改造以及亲和力提高，或者直接筛选制备人源化/全人抗体，加速了单抗的临床转化和应用。

抗体人源化
全人源、人源化和鼠源抗体分别占临床应用单抗的51%、46%和3%，可见人源化和全人源单抗已经成为治疗性抗体研发的主流。人源化抗体具有免疫原性低，体内半衰期长，有效诱导ADCC、CDC效应等优点。早期的人源化技术是将鼠单抗的可变区与人抗恒定区相连从而获得嵌合抗体。选择性阻断血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体的阿昔单抗（Abciximab）于1994年被美国FDA批准用于抑制血小板聚集，成为第一个嵌合抗体药物，抗CD20嵌合抗体利妥昔单抗于1997年被美国FDA批准用于非霍奇金淋巴瘤，成为首个用于肿瘤的嵌合抗体。
为了提高抗体人源化程度，CDR移植技术应运而生，将除了CDR区以外的序列替换为人源（如果鼠抗FR框架中的某些氨基酸对维持抗原的识别至关重要，那么这些残基也需要保留），进一步降低免疫原性。如FDA于1997年批准的首个用于预防移植排斥反应的人源化单抗——抗IL-2受体抗体达利珠单抗（Daclizumab），而最著名的人源化抗体当属1998年获批的抗HER2单抗曲妥珠单抗（Herceptin），从诞生以来连续登上十大药物畅销榜。
目前，普健生物提供完善的抗体人源化服务，仅需提供原始抗体序列，普健可帮助客户通过成熟的方法分析抗原-抗体复合物的结构，了解直接作用的关键残基，完成人源化抗体设计，通过一站式抗体平台完成基因合成及克隆、瞬转表达纯化等服务，并形成实验报告。
服务优势
1、普健生物拥有经验丰富的抗体人源化团队，团队的技术专家曾经成功研制上市的治疗性抗体药物
2、普健生物拥有自主开发的高表达载体及细胞系，以及具有商业开发license的细胞系
3、普健生物具有一站式从细胞系开发，到发酵培养条件优化，再到150L细胞罐发酵，完成整个治疗性抗体的研发能力


噬菌体展示技术
噬菌体展示技术是基于噬菌体表面蛋白（如PⅢ蛋白）的结构及包装特点，将外源抗体基因和外壳蛋白融合表达并展示在鞭毛表面，实现靶抗原特异性抗体的快速筛选。1985年，GeorgeP.Smith使用重组DNA技术，将外源肽与噬菌体M13的外壳蛋白PⅢ融合，在噬菌体表面展示肽。此后他创建了“抗体选择性噬菌体载体”，能够从1×10⁸库容噬菌体池中筛选特异性抗体。噬菌体展示抗体的形式可以是单链抗体（singlechainantibodyfragment，scFv）或Fab片段，scFv由VH和VL组成，二者之间由一个短而灵活的连接肽相连，而Fab具有相对较高的稳定性，其结合能力与完整的IgG抗体相当。
由于噬菌体颗粒小、容易扩增和富集，溶解度高（1×10¹³pfu/mL），因此可以实现抗体的大容量展示。噬菌体展示文库的基因库可以从原始或免疫人类或动物中获得，也可以使用随机CDR合成法构建文库，只要库容足够大，都可以产生针对多种抗原靶点的高亲和力抗体（亲和力达纳摩尔级）。普健生物基于丰富的噬菌体抗体技术经验以及上百个噬菌体展示抗体项目成功开发经验，具有全人源重组抗体库，库容高达千亿级别(10¹¹pfu），支持两步建库法，保证了文库的多样性，抗体库片段插入正确率高，可以两周拿到全人源重组抗体，并支持构建多种物种(人源、小鼠、兔子、羊驼等)、多种类型(scfv、Fab、VHH等)的抗体文库。


FDA已经批准了多种从噬菌体展示文库中获得的全人源抗体。如2002年获批上市的阿达木单抗（Adalimumab），迄今仍是世界上最畅销的药物。

转基因动物
转基因动物是全人源抗体的又一重要来源，通过对细胞系进行基因改造，将人类免疫球蛋白（Ig）基因取代动物内源性Ig基因，使这些动物在免疫后能够合成人类抗体。首个转基因小鼠来源的全人抗体帕尼单抗（Panitumab）是抗EGFR抗体，于2006年获得美国FDA批准。同样来源于转因因动物技术的还有2种用于自身免疫性皮肤病的人抗：IL-17α抗体司库奇尤单抗（Secukinumab）以及IL-17R抗体柏达鲁单抗（Brodalumab），分别于2015年和2017年获得美国FDA批准用于银屑病。

单B细胞抗体技术
使用传统的杂交瘤技术、抗体库或转基因小鼠技术生产治疗性人类抗体往往需要长期的免疫程序和多轮筛选，而单细胞抗体技术可以从外周血中直接进行阳性细胞分选和抗体基因克隆，直接进入哺乳动物细胞表达步骤，因此在突发传染病等紧急情况下，单B细胞抗体技术的优势尤为明显。普健生物新型的Xten™MabSingleB兔单克隆抗体开发技术平台，利用B细胞分选富集策略，在流式分选设备的支持下，有效富集抗原特异性B细胞，提高B细胞体外培养的成活率，保留B细胞的多样性，可开发出不同应用需求的抗体。
案例展示：

总体而言，治疗性抗体领域发展迅速，拥有巨大的发展潜力。基于已有的单抗研发技术，结合下一代测序技术、高通量筛选、抗体恒定区改造技术，借鉴新型支架蛋白、修饰抗体以
及抗体分子设计等经验，可以最大限度地提高抗体药物的疗效和安全性，展现最优药效、药代及药理特性。

参考文献
[1]FENGJiannan,QIAOChunxia.Progression on research technology of human therapeutic antibody.[J].Journal of Nanjing Medical University(Natural Sciences),2020,40(11):1571-1574.