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非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus, ASFV)感染引起的以广泛性出血为主要症状的急性高度接触性烈性传染病，发病率和死亡率高，最急性和急性型感染的死亡率可高达100%，目前尚无用于防治ASF的商业疫苗或药物。
p72蛋白是ASFV最外层蛋白质外壳的主要组成成分，约占病毒颗粒总质量的32%，在病毒感染晚期表达，参与ASFV结合和内化入侵宿主细胞、病毒膜运输和迁移等过程。p72蛋白是检测病毒时的主要抗原，由于其抗原性稳定，常被用于血清学诊断。相对于抗体检测，抗原检测可更快速地检出ASFV，比较常用的方法是双抗体夹心Elisa法和胶体金免疫层析技术。
以纯化的原核表达的p72重组蛋白作为抗原免疫3只Balb/c小鼠，共免疫3次，每次免疫间隔14d。随后进行小鼠血清抗体效价的检测，当免疫小鼠血清孔OD450值（P）/阴性小鼠血清孔OD450值(N)≥2.1时，判定所检测物质为阳性。取小鼠脾细胞进行细胞融合及阳性细胞株的筛选，，挑选出5株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，并将其分泌的单克隆抗体分别进行蛋白免疫印迹（Western Blot，WB）鉴定、免疫荧光鉴定。随后，鉴定５ 株杂交瘤细胞的单克隆抗体亚型，选择其中效价水平较高的３株单克隆抗体进行纯化，对小鼠腹腔注射能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，1×105个/只，以辛酸－硫酸铵法纯化腹水中的单克隆抗体，采用微量紫外分光光度计测定浓度，再通过SDS-PAGE鉴定纯化与未纯化的单克隆抗体纯度。
利用大肠杆菌原核表达系统可快速获得大量重组蛋白，但由于原核表达系统表达的蛋白质修饰不完整，天然活性低，而真核表达系统表达的重组蛋白更接近于天然蛋白。这项研究中，在制备p72重组蛋白单克隆抗体时，以大肠杆菌原核表达系统表达的p72重组蛋白作为免疫抗原对小鼠进行免疫，再用真核表达系统表达的p72重组蛋白进行筛选，从而避免了假阳性结果，提高了试验结果的准确性。
通过重组蛋白表达技术制备ASFV的p72重组蛋白和使用杂交瘤细胞技术制备抗p72蛋白的单克隆抗体，将纯化后的单克隆抗体与p72兔源多克隆抗体组合并初步建立用于检测p72抗原的双抗体夹心Elisa方法，可以为建立快速、高效、便捷的检测ASFV的方法提供依据。
参考文献：
- 谢林梅,唐子木,钱新杰等.非洲猪瘟病毒p72重组蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立[J].黑龙江畜牧兽医,2023(13):5-11.DOI:10.13881/j.cnki.hljxmsy.2022.05.0097.
- 杨晓红.非洲猪瘟病毒P72基因单克隆抗体的制备及其重组杆状病毒的构建[D].华中农业大学,2012.DOI:10.7666/d.Y2161969.
- 石正发,马源,袁洪,王由森,朱晓霞,车亮,李甲,羊倩倩,孙晓林.非洲猪瘟病毒p72蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立[J].中国预防兽医报,2023,45(5):488-493,547.DOI:10.3969/j.issn.1008-0589.202210015.
