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骨形态发生蛋白4（Bone morphogenetic protein 4,BMP4）是骨形成蛋白家族的一员，隶属于 TGF-β超家族，在调节胚胎发育、干细胞分化和成人组织稳态等方面起重要的调控作用。
在过往的研究中，Klösch等将鼠源BMP4在重组大肠杆菌中进行了表达，但表达系统不能对外源蛋白进行修饰，会形成不溶解、无活性的包涵体，并存在后期蛋白复性实验烦琐、复性率较低等问题；Cha等将人源BMP4在中国仓鼠卵巢细胞中进行了表达，结果证明哺乳动物活细胞表达系统在大量生产蛋白时成本较高，不适合大规模生产的需求。在BMP4蛋白纯化方面，普遍选择使用亲和层析技术，如免疫亲和层析、染料－配体亲和层析、固定化金属离子亲和层析等，但亲和层析技术虽然操作方便，却同样存在成本较高、不宜大规模生产等问题。因此，优化BMP4表达方法、提高利用效率、降低纯化成本，对后续研发和生产至关重要。
毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（Alcohol oxidase，AOX）编码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢，含AOX1 启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。在此研究中，来自吉林师范大学生命科学学院、吉林大学基础医学院的研究人员以骨形态发生蛋白（BMP4）为研究对象，将BMP4基因与IgG Fc 基因结合，改造成为BMP4融合蛋白，经毕赤酵母诱导表达和DEAE阴离子纯化获得目的蛋白，并利用间充质干细胞验证了其生理活性。
毕赤酵母表达系统是目前较为常见的表达系统之一，其优点在于表达高效、稳定性好、生产成本低，可根据需要选择胞内或胞外分泌路径。其中，胞外分泌表达纯化工艺简单、生产成本低，适用于工业生产。用不同质量分数的甲醇对同一菌种进行诱导并对重组蛋白纯化进行优化。
离子交换层析方法可以根据电荷性质差异分离电离分子，具有处理能力强、适用广泛、成本
适中等优点，同时还有易于放大和自动化处理等特性，在大批量生产中发挥重要的作用。采用离子交换层析法分离、纯化目的蛋白，通过BMP4形成二聚体时具有促进间充质干细胞增殖的特性，验证了BMP4-Fc融合蛋白的活性。
毕赤酵母表达系统可对目的蛋白进行翻译后修饰，具有高效分泌表达的真核表达系统。毕赤酵母表达系统主要优势：
1. 含有特有的强有力的 AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达
2. 产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中
不含蛋白，有利于下游产品分离纯化
3. 外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能够得到高表达菌株
4. 作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能
该项研究进一步纯化了重组蛋白、优化了DEAE离子交换层析条件，发现在230mmol/L NaCl和20mmol/L Tris-HCl混合液洗脱条件下，可以除去大部分杂蛋白，得到纯度较高、生理活性好、接近商业化纯品水平的目的蛋白，为BMP4的进一步研究、开发和利用提供了参考依据。
参考文献：
[1].ZHAO Zhuo,JI Hao-tian,XIAO Ye-chen.Vector construction and purification analysis on recombinant BMP4 protein in Pichia pastoris.[J].JournalofNortheastNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Vol.54No.1.March 2022
