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一、需求分析
客户需求：可提供蛋白序列，希望得到纯度85%左右的500μg蛋白，蛋白后续用于酶活实验，项目预算有限，后期可能需要大量蛋白。
需求分析
如项目预算有限，建议优先选择原核表达系统，成本较为低廉，如后续需要进行大体积放大，可直接进行发酵，工艺成本更低;对于酶的表达，普健的大肠杆菌表达系统在已往项目中有较为积极的客户反馈; 基于以上分析，普健建议该项目选用大肠杆菌表达系统。
二、蛋白性质分析
将蛋白序列在蛋白数据库Uniport中比对，一致性较高为80.9%，用生物信息学工具进行蛋白性质分析。
跨膜结构域预测：
信号肽预测：
疏水性预测：
蛋白性质总结：客户提供蛋白序列一共234 AAs，蛋白大小为25.39 KDa，pI为8.80，疏水性一般，无跨膜结 构域，无信号肽，无糖基化及二硫键修饰。
三、实验设计
综合蛋白性质及客户需求分析，设计蛋白表达方案如下：选择大肠杆菌表达系统，表达目的蛋白全长，N端融合6*His标签，表达载体为pET28b，选用BL21(DE3)、T7E为表达菌株，设置多个诱导温度及诱导时间，根据表达测试结果，选择最优条件进行200mL放大，收集样品采用Ni柱纯化，交付蛋白样品。
四、实验方法及实验结果
1、表达载体构建
利用生物信息学工具对目的蛋白全长片段进行密码子优化，降低稀有密码子水平，用化学合成方法获得目的蛋白基因序列片段，将片段亚克隆到pET28b表达载体，进行双酶切验证及测序确认。进行双酶切验证及测序确认。
测序结果：
双酶切验证结果：
结果分析：NdeI/XhoI双酶切测试结果显示片段大小正确，测序结果显示序列一致，确认蛋白表达载体构建成功。
2、表达测试
将表达载体转化至BL21(DE3)菌株、T7E菌株，挑取阳性克隆转移到含Kana抗性的LB培养基上，37℃培养3-4h，加入1mM IPTG诱导表达，一组37℃培养4h，另一组16℃培养16h过夜，收集蛋白样品进行SDS-PAGE检测。
SDS-PAGE结果：
结果分析：根据SDS-PAGE结果，蛋白大小在25KD左右，与预测蛋白大小相符，比较各条件下蛋白表达情况，确认该蛋白最优的表达条件如下：
| 菌株 | 温度 | 诱导时间 |
| T7E 菌株 | 37℃ | 4h |
3、放大纯化
按照得到的最优表达条件，转化200mL大肠杆菌，37℃培养3-4h，1mM IPTG诱导后，37℃培养4h，收集蛋白样品，用Ni柱进行蛋白纯化，得到最终蛋白样品。
4、QC检测
将最终得到的蛋白样品进行浓度测定、SDS-PAGE检测及His标签抗体的WB检测。
SDS-PAGE检测及WB检测结果：
结果分析：SDS-PAGE结果显示蛋白大小在25KD左右，且蛋白纯度较好，约为95%; His标签抗体的WB检测结果显示25KD左右曝出条带，与目的蛋白预测大小相符。
五、交付材料
| 序号 | 样品 | 浓度 | 分装 | 缓冲液 | 管数 |
| 1 | 蛋白 | 1.00mg/ml | 1.50ml/管 | PBS pH7.5 | 2管 |
| 2 | 表达载体 | 100ng/ul | 15ul/管 | TE | 1管 |
| 3 | 表达菌株 | / | 1.00ml/管 | / | 1管 |
| 合计管数: | 4管 | ||||
六、项目结题
从基因合成到交付蛋白样品，项目为期5周，得到3.00mg目的蛋白样品，由于酶活测试的多样性与特殊性，交付给客户进行验收及酶活测试，客户验证蛋白大小纯度均与QC结果一致，酶活实验结果表明蛋白有生物活性，综上，项目顺利结题。
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