哺乳动物细胞蛋白表达案例

一、实验设计

　　根据客户的预期蛋白量、纯度以及蛋白用途等需求，通过哺乳系统来分泌表达纯化目的蛋白。设计思路为：密码子优化最适宜哺乳系统的基因序列，将目的蛋白序列构建到普健生物自主研发的高效表达载体pATX2，N端添加哺乳系统常用信号肽利于分泌表达，C端添加His标签，便于蛋白的检测和亲和纯化，瞬时转染哺乳细胞HEK293，通过SDS-PAGE检测蛋白表达情况，收集培养基部分用镍柱亲和纯化获得目的蛋白。

二、蛋白性质分析

　　2.1信号肽分析

　　2.2疏水性分析

　　2.3跨膜结构域分析

　　综上所述：

　　1.目的蛋白理论分子量为 43KDa，适宜表达。

　　2.对蛋白的信号肽，跨膜结构域和亲疏水性分析，蛋白整体疏水性略强。

　　3.目的蛋白自身无信号肽，添加哺乳系统常用信号肽，利于蛋白分泌表达。

　　4.在C端添加His标签，便于蛋白的检测和亲和纯化。

三、实验方法

　　3.1 转染前一天，接种细胞到完全培养基中培养，使细胞在转染当天处于对数生长期。

　　3.2 转染复合物的准备。

　　3.3 转染：加入转染混合物到细胞悬液中，轻柔混匀后培养至细胞活率降到50%以下收样。

　　3.4 收集表达后的细胞液，将培养基上清标记为culture medium;细胞加入1×PBS混匀，超声后离心，上清吸至新的EP管中，标记为NPE，沉淀加入1×PBS(含8M尿素)，混匀，标记为DPE。

　　3.5 镍柱亲和纯化：

　　3.5.1 用PBS，pH 7.5缓冲液平衡镍柱，以0.5 ml/min流速上样;

　　3.5.2 用Wash-Buffer以1 ml/min流速冲洗;

　　3.5.3 用Elution-Buffer以1 ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液;

　　3.5.4 将上述收集的蛋白溶液放入透析袋中，使用PBS(pH 7.5)进行透析过夜;

　　3.5.5 进行SDS-PAGE分析。

四、实验结果

　　4.1 蛋白镍柱亲和纯化样品SDS-PAGE分析：

　　4.2纯化后样品浓缩透析之后进行SDS-PAGE分析：

　　结论：目的蛋白已成功表达纯化，并且纯化得到的蛋白纯度较高，在90%以上。

五、样品信息

六、结论

　　目的蛋白表达量为62.5 mg/L, 纯度大于90%。

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