大肠杆菌原核蛋白表达的操作步骤和相关注意事项

　　采用大肠杆菌表达蛋白是现阶段使用非常广泛的一项技术，我们一般将这种方法称为原核表达。这个方法的使用范围非常的广泛，比如在蛋白纯化、定位以及相关蛋白功能分析等。因为大肠杆菌易于控制和生长，而且价格相对便宜，使得其使用极为广泛。

　　大肠杆菌蛋白表达时，常常会使用载体(通常为质粒)来表达目的蛋白。原核表达通常按照：获得目的蛋白、构建表达载体、插入目的基因、培养宿主菌、诱导蛋白表达、蛋白分析，最后通过扩增、纯化等操作后，进行进一步检测;

　　其具体操作步骤如下：

　　1、获得目的基因

　　获得目的基因的方法主要有两种，一种是PCR方法，一种是RT-PCR方法，另外一种是人工合成法。

　　PCR法：以含有目的基因的克隆质粒为模板，通过基因序列设计一对引物，从而获得基因片段;

　　RT-PCR法：从细胞或组织中提取RNA，而后以RNA逆转录出cDNA第一链，而后以逆转录为模板获得目的基因;

　　人工合成法：通过检测到的目的基因序列，合成重叠的单链寡合苷酸，而后通过重叠延伸PCR法拼接出全长;

　　2、构建表达载体

　　使用限制性内切酶将质粒进行双酶切，而后对酶切的产物进行琼脂糖电泳，从而获得载体大片段，而后通过相关技术手段将目的基因连入载体;

　　3、质粒构建

　　将连接产物转入大肠杆菌，而后对相关细菌进行挑选，再然后通过裂解法提取质粒，最后检测目的基因的插入方向并论证其正确性;

　　4、诱导表达

　　对含有目的基因的菌体进行培养，而后取部分液体与未诱导组进行对照，培养完成后，离心后取上清液作为样品;

　　大肠杆菌蛋白表达的注意事项有哪些?

　　1、在我们选择表达载体时，一定要根据蛋白的最终应用来进行选择;

　　2、在进行外源DNA连接时，需要确保其转录与转移过程中不会出现相互干扰的情况;

　　大肠杆菌蛋白表达作为现阶段使用最为广泛的原核蛋白表达系统，因为其遗传背景清晰的优势，在蛋白表达上有着极大的优势。在进行相关蛋白表达时，需要严格按照实验标准来操作，这样才能在更大程度上保证蛋白的表达。武汉普健生物专业为广大用户提供原核蛋白表达服务，如果您有相关需求，欢迎来电咨询。