噬菌体抗体库筛选

发表时间：2022-01-22 访问次数：2063

　　本案例基于普健生物大肠杆菌表达系统，采用pET28b载体，融合表达了结核分枝杆菌的3个蛋白(A+B+C，中间用GGGGS接头连接，N端添加6*His标签用于蛋白纯化)作为免疫原免疫了2只新西兰大白兔，构建了库容高达1.56×10^10 CFU的噬菌体展示兔scFV抗体文库，并用A-B-C蛋白作为筛选原，淘选得到了4条不同的针对A蛋白的抗体序列交付客户。

　　1.抗原制备

　　A蛋白分析：

　　A蛋白一共228AAs; 1-23 AAs为信号肽，分子量22kDa，疏水性一般; 普健生物选取的表达区段为23-228 AAs;

　　蛋白A信号肽分析结果：

噬菌体展示抗体库构建及淘选

　　蛋白A疏水性分析结果：

噬菌体展示抗体库构建及淘选

　　B蛋白分析：

　　B蛋白一共95AAs，无信号肽，9.9kDa，有2个跨膜区，疏水性很强; 普健生物选取的表达区段为全长;

　　噬菌体展示抗体库构建及淘选

蛋白B结构示意图

　　C蛋白分析：

　　C蛋白一共100 AAs; 无信号肽，分子量10.79 kDa，有1个无序区，疏水性较强; 普健生物选取的表达区段为全长;

噬菌体展示抗体库构建及淘选

蛋白C结构示意图

　　表达的融合蛋白序列示意图如下：

　　>His-A-B-C(421 AAs;44.97 kDa;pI:4.85)

　　MGSHHHHHHSG-A-GGGGS-B-GGGGS-C

　　通过密码子优化及基因合成，亚克隆，表达纯化，得到的融合蛋白质检图如下：

噬菌体展示抗体库构建及淘选

　　A. 考马斯亮蓝染色. B. His 标签抗体WB鉴定蛋白 (ECL曝光).

　　缓冲液：PBS pH7.5; 纯度：>90%; 浓度:1mg/ml

　　2.兔scFv抗体库构建

　　(1)免疫新西兰大白兔

　　将融合蛋白免疫两只兔子，共免疫四次，免疫间隔两周，检测第三次和第四次的免疫效价，效价达到要求后(大于 1:32000)进行采血，效价结果如下：

稀释比例	兔子 A			兔子B
稀释比例	免疫前血清	3免血清	4免血清	免疫前血清	3免血清	4免血清
500	0.02	2.94	3.14	0.04	3.04	3.16
1000	0.01	2.73	2.93	0.02	2.93	2.94
2000	0.01	2.20	2.30	0.01	2.80	2.30
4000	0.01	1.84	1.94	0.01	1.94	1.93
8000	0.01	1.34	1.64	0.01	1.64	1.65
16000	0.01	1.15	1.55	0.01	1.45	1.55
32000	0.01	0.68	0.78	0.01	0.78	0.79
64000	0.01	0.43	0.63	0.01	0.63	0.65
128000	0.01	0.20	0.40	0.01	0.50	0.42
256000	0.01	0.11	0.21	0.01	0.13	0.24
512000	0.01	0.06	0.20	0.01	0.06	0.21
0	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01

　　(2)抗体文库构建

　　总 RNA 提取(全血和淋巴细胞)，RNA提取结果如下：

噬菌体展示抗体库构建及淘选

图1.总 RNA凝胶电泳图.

M: 10kb DNA Ladder, 1: 兔子A总RNA; 2: 兔子B总RNA.

　　反转录获得 cDNA，可变区片段扩增并克隆至 M13 噬菌粒，2步法建库，先连入轻链，再连入重链，轻链( VK和 Vλ )酶切结果如下：

噬菌体展示抗体库构建及淘选

图2. VK和 Vλ 轻链片段酶切(NheI, NotI)

M: DL2000

1: A兔子VK 片段; 2: A兔子VK 片段(NheI, NotI)

3: A兔子Vλ 片段; 4: A兔子Vλ 片段 (NheI, NotI)

5: B兔子VK 片段; 6: B兔子VK 片段 (NheI, NotI)

7: B兔子Vλ片段; 8: B兔子Vλ片段.

　　原始载体酶切结果如下：

噬菌体展示抗体库构建及淘选

图3.pATA-scFv-2 载体酶切结果(NheI, NotI, KpnI).

M: 1kb DNA Ladder , 1: pATA-scFv-2 , 2: pATA-scFv-2(NheI, NotI, KpnI)

　　将轻链载体转化 TG1 ，构建噬菌体文库，对单克隆进行菌落 PCR 分析，挑选阳性克进行测序，PCR鉴定结果如下：

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图 4. PCR鉴定48个克隆结果

M: DL2000, 1-24: pATA-VK; 25-48: pATA-Vλ.

　　将PCR阳性的克隆测序，测序引物为 M13-48，得到的轻链文库库容如下：

　　pATA -VK 噬菌体抗体库库容 =1.44×10^9 cfu,

　　pATA -Vλ 噬菌体抗体库库容 =1.43×10^9 cfu。

　　将重链酶切后连入轻链载体构建scFV文库，轻链载体酶切结果如下：

噬菌体展示抗体库构建及淘选

图 5. pATA-VK 和pATA-Vλ 酶切结果(SfiI, XhoI, NcoI).

　　M: 1 kb DNA Ladder

　　1: pATA-VK;2:pATA-VK(SfiI, XhoI) ;3:pATA-Vλ;4: pATA-Vλ(SfiI, XhoI)

　　重链片段酶切结果如下：

噬菌体展示抗体库构建及淘选

图 6. VH酶切 (SfiI, XhoI).

M: DL2000 , 1: VH 片段, 2:VH 片段(SfiI, XhoI)

将重链分别连入轻链(K和λ)载体后转化TG1进行scFV文库克隆PCR鉴定，结果如下：

图 7. pATA-scFv-KH克隆PCR鉴定结果

M: DL2000, 1-48: pATA-scFv-KH.

噬菌体展示抗体库构建及淘选

图 8. pATA-scFv-λH克隆PCR凝胶电泳图

M: DL2000, 1-48: pATA-scFv-λH

　　最后构建的pATA-scFv-VH库容如下：

　　pATA-scFv-KH 噬菌体展示文库库容 =1.56×10^10 cfu,

　　pATA-scFv-λH 噬菌体展示文库库容=1.03×10^10 cfu。

　　3. scFV抗体文库固相淘选

　　将得到的融合蛋白A-B-C 按照下表条件进行淘选：封闭，噬菌体-抗原反应，洗脱，测定滴度。

　　表2 每一轮淘选条件

轮数	包被抗原(μg/mL)	封闭缓冲液	洗涤次数	洗脱产物(ul)
1	A-B-C (50)	5% milk/PBST	5	800
2	A-B-C (50)	5% milk/PBST	5	700
3	A-B-C (50)	1% Casein/PBST	5	600
4	A-B-C (100)	5% milk/PBST	5	600
5	A-B-C (100)	1% Casein/PBST	6	600

　　重复5轮，根据结果判断是否有特异性富集：

表3. 淘选结果

轮数	蛋白	投入(pfu)	输出(pfu)
1	A-B-C (50)	1×1012	1.1×107
2	A-B-C (50)	4.4×1011	1.7×108
3	A-B-C (50)	2×1012	3×106
4	A-B-C (100)	8.5×1011	3×106
5	A-B-C (100)	3×1011	1.2×107

　　(3)多克隆ELISA实验验证，结果如下：

表4. 多克隆噬菌体ELISA结果（Ag:A-B-C；NC: PBS）

噬菌体（pfu/ml）	1轮		2轮		3轮		4轮		5轮
噬菌体（pfu/ml）	抗原	阴性对照	抗原	阴性对照	抗原	阴性对照	抗原	阴性对照	抗原	阴性对照
1×1012	0.34	0.20	0.30	0.22	1.16	0.31	0.88	0.12	4.20	0.18
3.16×1011	0.22	0.28	0.20	0.13	1.55	0.30	1.68	0.12	3.21	0.11
1×1011	0.26	0.20	0.13	0.09	0.89	0.52	2.56	0.07	2.19	0.09
3.16×1010	0.24	0.13	0.09	0.07	0.37	0.32	1.42	0.07	1.56	0.09
1×1010	0.23	0.14	0.07	0.07	0.22	0.52	1.03	0.03	1.02	0.04
3.16×109	0.21	0.13	0.10	0.07	0.15	0.18	0.40	0.03	0.61	0.04
1×109	0.17	0.18	0.11	0.11	0.14	0.31	0.24	0.02	0.35	0.05
blank	0.25	0.17	0.13	0.15	0.18	0.32	0.05	0.04	0.03	0.07

　　根据以上结果，我们选取了第3/4/5轮淘选所得噬菌体进行了单克隆ELISA检测：

表5.单克隆ELISA结果（抗原-R3P1）-抗原: A-B-C ；阴性对照: PBS

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.07	0.06	0.07	0.11	0.07	0.11	0.19	0.23	0.23	0.26	0.28	0.38
B	0.09	0.05	0.09	0.10	0.12	0.12	0.15	0.24	0.19	0.24	0.33	0.39
C	0.07	0.04	0.08	0.08	0.07	0.13	0.21	0.16	0.27	0.25	0.29	0.46
D	0.07	0.06	0.06	0.05	0.11	0.22	0.11	0.16	0.26	0.31	0.34	0.41
E	0.06	0.03	0.05	0.04	0.16	0.11	0.06	0.06	0.21	0.33	0.36	0.33
F	0.07	0.06	0.05	0.09	0.16	0.14	0.16	0.19	0.17	0.27	0.16	0.28
G	0.06	0.07	0.06	0.09	0.11	0.14	0.06	0.19	0.34	0.32	0.45	0.19
H	0.08	0.09	0.08	0.23	0.23	0.27	0.21	0.30	0.21	0.39	0.38	0.21

表6.阴性对照结果 (NC-R3P1)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.05	0.05	0.03	0.08	0.07	0.04	0.11	0.12	0.22	0.41	0.49	0.45
B	0.05	0.08	0.04	0.11	0.06	0.06	0.08	0.12	0.15	0.44	0.33	0.44
C	0.05	0.04	0.04	0.07	0.09	0.04	0.09	0.11	0.27	0.23	0.27	0.42
D	0.05	0.04	0.03	0.09	0.05	0.04	0.07	0.12	0.17	0.26	0.26	0.44
E	0.04	0.03	0.03	0.04	0.05	0.06	0.06	0.12	0.24	0.13	0.16	0.34
F	0.06	0.04	0.05	0.08	0.07	0.04	0.08	0.11	0.22	0.12	0.22	0.46
G	0.06	0.06	0.07	0.09	0.07	0.07	0.10	0.16	0.16	0.20	0.26	0.37
H	0.07	0.09	0.06	0.12	0.10	0.09	0.15	0.21	0.19	0.21	0.33	0.36

　　表7.单克隆ELISA(Ag-R4P1)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.07	0.03	0.03	0.03	0.03	0.03	0.04	0.04	0.05	0.04	0.05	0.04
B	0.08	0.03	0.46	0.02	0.02	0.02	2.63	0.09	0.04	0.03	0.09	0.04
C	0.12	0.02	0.03	0.02	0.03	0.02	0.02	0.03	0.05	0.03	0.07	0.03
D	0.09	0.02	0.02	0.03	0.02	0.03	0.03	0.03	0.03	3.17	0.06	0.08
E	0.09	0.03	0.02	0.02	0.03	0.03	0.03	0.04	0.04	0.03	0.09	0.09
F	0.12	0.04	0.03	0.02	0.04	0.03	1.69	0.05	0.04	0.03	0.04	0.10
G	0.08	0.03	0.03	0.03	0.04	0.04	0.04	0.05	0.05	0.07	0.09	0.11
H	0.12	0.05	0.03	0.04	0.06	0.07	0.08	0.14	0.10	0.10	0.09	0.18

表 8.单克隆ELISA(NC-R4P1)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.03	0.03	0.04	0.03	0.04	0.03	0.04	0.04	0.10	0.11	0.14	0.22
B	0.05	0.03	0.03	0.02	0.05	0.03	0.03	0.03	0.06	0.05	0.09	0.22
C	0.06	0.02	0.03	0.03	0.03	0.04	0.03	0.04	0.07	0.05	0.13	0.20
D	0.05	0.03	0.03	0.03	0.04	0.03	0.03	0.03	0.04	0.05	0.12	0.26
E	0.07	0.03	0.05	0.04	0.08	0.05	0.05	0.07	0.09	0.10	0.14	0.28
F	0.06	0.04	0.04	0.05	0.05	0.08	0.05	0.06	0.07	0.12	0.20	0.25
G	0.08	0.03	0.03	0.03	0.06	0.03	0.05	0.06	0.04	0.04	0.05	0.22
H	0.09	0.06	0.05	0.07	0.07	0.09	0.09	0.07	0.10	0.12	0.16	0.27

　　表 9.单克隆ELISA(Ag-R5P1)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.09	0.06	0.02	0.03	1.03	0.03	0.05	0.04	2.01	0.04	0.10	2.74
B	2.00	2.02	0.02	0.01	0.06	1.47	1.91	0.01	0.02	0.08	1.71	0.09
C	0.03	0.02	0.01	1.46	0.01	1.02	2.27	1.80	1.60	1.59	0.02	0.08
D	1.79	0.02	0.01	0.01	0.01	0.02	0.02	0.02	0.22	0.01	0.01	0.06
E	0.02	1.50	0.02	0.02	0.02	0.02	0.01	0.01	0.01	0.01	1.42	1.42
F	0.02	0.02	1.65	0.99	0.01	0.02	1.51	0.02	0.02	1.95	0.01	0.09
G	0.03	1.83	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.03	0.03	2.05
H	0.14	1.66	0.10	0.67	2.16	0.12	2.24	0.10	0.11	1.89	0.13	0.27

　　表 10.单克隆ELISA(NC-R5P1)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	0.03	0.02	0.02	0.02	0.04	0.03	0.03	0.04	0.04	0.06	0.05	0.06
B	0.04	0.03	0.02	0.01	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.04	0.02	0.10
C	0.03	0.02	0.02	0.01	0.01	0.02	0.02	0.02	0.01	0.02	0.04	0.14
D	0.03	0.02	0.02	0.01	0.02	0.02	0.02	0.01	0.01	0.01	0.03	0.08
E	0.03	0.03	0.02	0.01	0.02	0.02	0.02	0.02	0.01	0.01	0.02	0.07
F	0.03	0.02	0.02	0.01	0.02	0.02	0.02	0.02	0.01	0.01	0.02	0.06
G	0.03	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.02	0.03	0.02	0.02	0.03	0.06
H	0.04	0.07	0.06	0.04	0.04	0.05	0.03	0.05	0.06	0.04	0.04	0.17

　　根据以上结果，将阳性克隆进行测序，得到了 14条不同的序列,针对14个阳性克隆采用A-B-C和A蛋白(甲方提供)又进行了二次验证，结果如下：

表 11. 二次验证ELISA结果

克隆编号	抗原1	抗原2	阴性对照
R5P1-A9	1.8424	0.1964	0.1172
R5P1-A12	2.339	0.1355	0.146
R5P1-B1	2.296	0.1848	0.1593
R5P1-B6	2.1471	0.3191	0.309
R5P1-B11	1.868	0.2985	0.3075
R5P1-C6	2.4653	0.3502	0.22650
R5P1-C7	3.8706	4.0711	0.20770
R5P1-C9	3.9672	4.441	0.14710
R5P1-C10	2.0621	0.1691	0.2446
R5P1-E12	1.956	0.1201	0.2052
R5P1-F10	1.9198	0.2083	0.3152
R5P1-G2	3.4017	3.3381	0.3472
R5P1-G12	2.5475	0.3953	0.4183
R5P1-H4	2.0672	2.7704	0.5009

　　根据以上结果，得到了4条针对蛋白A的序列，序列略(保密)。

　　4. 抗体重组表达

　　将得到的4个抗体重链和轻链可变区序列分别和兔重链恒定区和轻链恒定区(kappa)序列连接后基因合成，分别亚克隆到普健生物自有表达载体pATX2，共转XtenCHO细胞，收集培养上清后进行Protein A纯化，得到的抗体采用SDS-PAGE进行质检，纯度结果如图所示：

噬菌体展示抗体库构建及淘选

图9. 重组抗体质检图. 考马斯亮蓝

A. 还原PAGE. B. 非还原PAGE.

MW. 蛋白Marker.

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